что влияет на работу фибробластов
Факты о фибробластах
Тело человека состоит из триллионов разнообразных клеток. Наиболее важными клетками самого большого органа в теле человека – кожи, являются фибробласты. Их называют клетками молодости, так как именно активная работа фибробластов способствует поддержанию молодости и красоты кожи.
Фибробласты
Зародышевые клетки соединительной ткани организма. Они участвуют в процессах регенерации и синтеза белков, наиболее важных для омоложения клеток дермы.
В организме человека фибробласты могут находиться в двух формах: активные и неактивные. Активный фибробласт имеет большой размер, отростки, овальное ядро и много рибосом. Такая клетка может делиться и интенсивно вырабатывать коллаген. Неактивные фибробласты называются также фиброцитами. Они являются высокодифференцированными клетками, которые образовываются их фибробластов, не имеют способности к делению, но принимают активное участие в синтезе волокнистых структур и заживлении ран. Неактивные фибробласты имеют несколько меньший размер, чем активные, и отличаются веретенообразной формой.
Все активные фибробласты разделяются на несколько структурно-функциональных типов, каждый из которых выполняет определенные функции:
— малодифференцированные фибробласты обладают выраженными пролиферативными свойствами, то есть, они активно размножаются и растут;
— юные фибробласты – более дифференцированные клетки, которые также способны к пролиферации, но в отличие от малодифференцированных, могут синтезировать коллаген и кислые гликозаминогликаны;
— зрелые фибробласты образуются из юных форм, практически не могут размножаться, и разделяются на три подтипа:
Фибробласты располагаются в среднем слое кожи человека – в дерме. Там они вырабатывают внеклеточный матрикс, компоненты которого и формируют своеобразный каркас кожи. Основными компонентами внеклеточного матрикса являются гликопротеины, протеогликаны и гиалуроновая кислота. Широко известный коллаген является превалирующим гликопротеином внеклеточного матрикса. Кроме того, фибробласты продуцируют также белки фибрин, эластин, тинасцин, нидоген и ламинин, которые используются в качестве «строительного материала» для кожи.
Еще один продукт синтеза фибробластов – это факторы клеточного роста, к которым относятся:
Основные функции фибробластов:
С возрастом в организме человека способности фибробластов в плане активного синтеза и пролиферации в тканях кожи снижаются, в результате чего происходит уменьшение содержания их главных компонентов — гиалуроновой кислоты, коллагена, эластина, сосудистой сети. Это отражается на внешнем виде кожного покрова.
Сегодня, благодаря успехам биотехнологии, появилась возможность естественным путем повлиять непосредственно на причину возрастного увядания кожных тканей. Этого удалось достигнуть способом обогащения ее собственными молодыми фибробластами, которые являются строителями внеклеточного матрикса.
Трансплантация в кожу лица собственных молодых клеток фибробластов способна эффективно и достаточно быстро активизировать процессы обновления и восстановления ее структуры. Аутологичные (свои) клетки не воспринимаются собственной иммунной системой как антиген (чужеродные) и, следовательно, организмом не отторгаются, а полноценно функционируют. Преимуществом клеточного омоложения является и то, что трансплантированные фибробласты долгое время (от полугода до полутора лет) сохраняют функциональную активность в части усиленного синтеза гиалуроновой кислоты, коллагена, эластина и других компонентов матриксной системы кожи. В течение этого срока постоянно продолжается улучшение ее состояния.
Такая методика аутотрансплантации фибробластов в косметологии получила официальное разрешение Росздравнадзора.
Что такое фибробласты и почему на них стоит обратить внимание
Фибробласты — особые клетки кожи, поддерживающие ее молодость. С годами их количество уменьшается почти на 40% — это одна из причин ухудшения состояния кожи. Повлиять на ситуацию может SPRS-терапия — антивозрастная методика, основанная на действии фибробластов.
Лусине КАРАПЕТЯН, заведующая косметологическим отделением
Эстетической клиники ЕМС
Что такое SPRS-терапия
Как получить фибробласты
Далее образец отправляют в лабораторию, где проводят диагностику фибробластов, оценку функциональной активности клеток и их способности к делению. Отбирают лучшие клетки с высоким потенциалом и затем наступает этап выращивания фибробластов, который длится шесть недель.
SPRS-терапия
Выполняют инъекции по типу мезотерапии — микродозами на небольшую глубину и небольшое расстояние между точками вкола. Кожу предварительно обрабатывают анестетиком. В среднем курс состоит из двух процедур с интервалом в месяц-полтора. Однако каждому пациенту дают индивидуальные рекомендации, так как все зависит от уровня дефицита фибробластов в каждом конкретном случае и их способности к делению. Затем можно выполнять поддерживающую терапию раз в несколько лет. Все это время клетки можно хранить в криобанке.
Эффективность
Особенность
Показания
Надо отметить, что SPRS-терапия — весьма дорогостоящая, но эффективная процедура, которая, по утверждению специалистов, позволит выглядеть на 10-15 лет моложе без операций и реабилитаций.
Стоимость SPRS-терапии составляется из открытия собственного банка фибробластов, забора образца для выращивания фибробластов, введения фибробластов (цена определяется их количеством) и хранения материала в криобанке для последующих инъекций. В сумме стоимость может достигать 1 млн рублей и выше.
Родинка или бородавка: что такое кератома и как от нее избавиться
Если на коже вдруг появилось пигментное образование, всегда лучше не гадать о его безопасности, а сразу обратиться к дерматологу. Чаще всего речь идет о распространенной кожной проблеме — кератоме, которую еще называют себорейной, или старческой, бородавкой. При этом сегодня она все чаще появляется и у молодых пациентов.
Екатерина Давтян, кандидат медицинских наук, врач-дерматолог, косметолог, трихолог
@dr.ekaterina_davtyan
Кератома представляет собой базальноклеточную папиллому — доброкачественное кожное образование, которое, как правило, появляется с возрастом. Однако специалисты отмечают, что в настоящее время кератома может образоваться на коже уже с 30-летнего возраста. При этом точные причины ее появления пока не установлены. Из основных факторов риска отмечают генетическую предрасположенность, повышенную инсоляцию, иммунологические нарушения, вирус папилломы человека и длительное иммуносупрессивное лечение (химиотерапия и биотерапия).
Как выглядит кератома
Визуально кератома может выглядеть по-разному и со временем меняться: от пятен овальной и круглой формы до крупных бляшек с чешуйками; от светло-коричневого цвета до черного, размером от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров. Они могут быть мягкими, гладкими, шероховатыми, локализоваться на любом участке кожи (чаще на закрытых участках тела), на шее и лице, кроме кожи ладоней и подошв. Зачастую это множественные образования, чем единичные.
Всего различают около 10 типов кератом, каждый из которых различается внешним проявлением.
Кератоз следует отличать от других опухолей кожи, таких как бородавки, меланома, внутридермальные невусы (родинки), лихеноидный кератоз, базально-клеточной и плоскоклеточной карциномы кожи. Образования отличаются гиперкератозом — утолщением поверхностного слоя кожи, удлинением межсосочковых выростов эпителия, также характерным является наличие истинных роговых и псевдороговых кист.
Лечение кератомы
Медицина предлагает терапевтический и деструктивный метод терапии кератом. Лечение с помощью средств лечебных средств и косметики может уменьшить симптомы зуда, воспаления, но не способно бесследно устранить образования на коже. После деструктивного метода (удаление) следов практически не остается, поскольку образования поверхностные и не разрастаются глубоко в кожу.
Методы удаления кератом
Жидкий азот (криоудаление)
Самостоятельно лечить новообразование категорически нельзя. Без консультации врача-дерматолога поставить себе диагноз «на глаз» или по фото в интернете сложно и не нужно. Следует обратиться к врачу для дифференциальной диагностики. А для предупреждения перерождения образования из доброкачественного в злокачественное исключить травматизацию очагов (одеждой, мочалкой, скрабом, расчесыванием), избыточную инсоляцию, химические пилинги и другие раздражающие кожу средства.
Предупрежден — значит вооружен: как подготовиться к возрастным изменениям кожи
Первые возрастные изменения кожи мы начинаем замечать, как правило, около тридцати лет. С годами клетки изнашиваются, в них накапливаются повреждения и в результате появляются морщины, птоз, усталый вид. Но в наших силах сделать так, чтобы возраст дал знать о себе как можно позже. Никто не откажется выглядеть моложе на 5, а то и на 10 лет. Секретами успешной борьбы со старением делится врач-косметолог.
Татьяна Жукова, косметолог «Клиники инновационных технологий» в Куркино
Как известно, любое заболевание гораздо легче предотвратить, чем лечить. Это касается и естественных процессов старения. Поэтому одним из основных направлений косметологии является профилактика старения. Современные методы позволяют эффективно устранять возрастные изменения кожи лица без помощи пластической хирургии.
Как замедлить процессы старения
Для сохранения молодости в первую очередь необходимо уделять внимание здоровью кожи и не игнорировать принципы базового ухода. Важно правильно и подходящими по типу кожи средствами проводить следующие этапы:
Очищение. Избавляться от загрязнений и ороговевших клеток, стимулировать обновление кожи, чтобы она становилась гладкой, чистой и сияющей.
Увлажнение. Насыщать влагой эпидермис, активизировать обменные процессы.
Антиоксидантный уход. Помогать коже противостоять агрессивным факторам, пользоваться ухаживающими средствами с антиоксидантами, а также обогащать меню свежими овощами и фруктами.
Защита от ультрафиолета. Пользоваться средствами с SPF, защищать кожу от разрушительного воздействия солнца, замедлять фотостарение.
Профилактика старения в возрасте 25—35 лет
В возрасте 25—35 лет наибольшей эффективностью обладают процедуры, направленные на улучшение питания тканей, нормализацию лимфотока и стимуляцию кровообращения.
Микротоковая терапия воздействует на эпидермис, дерму, сосуды и мышцы лица электрическими импульсами сверхмалой частоты. Процедура запускает естественные процессы регенерации и способствует обновлению клеток.
улучшает синтез волокон коллагена и эластина;
нормализует работу сальных желёз;
оказывает противовоспалительное действие.
Мезотерапия — это внутрикожное введение коктейлей, которые содержат гиалуроновую кислоту, витамины, микроэлементы, аминокислоты и другие вещества, необходимые для здоровья и молодости кожи.
усиление выработки коллагена и эластина;
стимуляция процессов регенерации;
исчезновение мелких морщин и сокращение глубоких;
улучшение цвета лица.
Химический пилинг — воздействие на кожу химическими составами (кислотами) для коррекции эстетических недостатков. Процедура позволяет решать широкий спектр проблем: устранять акне и рубцы, морщины, пигментные пятна и другие несовершенства.
обновление кожного покрова;
устранение эстетических дефектов;
активация защитных ресурсов дермы.
Профилактика старения после 35 лет
На этом этапе используются программы опережающей коррекции, направленные на укрепление «слабых точек». К примеру, с помощью препаратов ботулотоксина можно устранить повышенную мимическую активность определенных зон и предотвратить образование глубоких морщин. Хороший эффект в борьбе с возрастными изменениями после 35 лет дают поверхностные химические пилинги, контурная пластика и биоревитализация.
Биоревитализация — процедура точечного подкожного введения препаратов на основе гиалуроновой кислоты. Она способствует увлажнению и улучшению внешнего вида кожи, замедляет старение и разглаживает морщины.
нормализация уровня влаги в коже;
активация выработки белков коллагена и эластина;
ускорение регенерации (обновлении клеточного состава);
стимуляция природного синтеза гиалуроновой кислоты.
Современная косметология имеет массу возможностей, чтобы сохранить здоровье и молодость кожи на долгие годы. Но чем меньше выражены признаки старения на момент вмешательства, тем эффективнее будут процедуры. Поэтому важно начать борьбу с возрастными изменениями как можно раньше.
Идеальная кожа: какая чистка лица самая эффективная
Чистка лица — одна из самых популярных процедур в салонах красоты. Но вариантов чисток много и часто возникает вопрос, какая из них самая эффективная и какую выбрать, чтобы не навредить коже, не потерять время зря и получить хороший результат. Мы попросили помочь разобраться в этом авторитетного врача-косметолога.
Екатерина Круглик, врач-косметолог, пластический хирург, главный врач сети клиник VIP Clinic
Какие бывают и зачем нужны чистки лица
Чистка лица бывает разная и подбирается исключительно по показаниям, поэтому какую чистку лица выбрать можно посоветовать только на очной консультации. Чтобы получить примерное представление о таких процедурах, рассмотрим метод подробнее. Основные разновидности чистки лица — это механические, ультразвуковые и химические. Есть еще атравматичные чистки, которые впрочем включают в себя механический компонент и в принципе считаются комплексными.
Во время чистки в зависимости от ее типа происходит мягкая или более серьезная эксфолиация рогового слоя кожи. Мы снимаем клетки кожи и способствуем выводу кожного сала из пор. Хочу напомнить, что комедоны (воспалительные элементы на коже) бывают как открытые, так и закрытые. Открытые называют черными точками, но важно понимать, что это не грязь, которая, как думают многие, скапливается в порах. Это пигмент меланин, который находится на поверхности кожного сала. Закрытые комедоны — это сальная железа, которая закрыта кожей, и при этом сало не может выйти на поверхность. Во время механической или ультразвуковой чистки такие комедоны, их еще называют внутренние прыщи, вскрываются и происходит очищение кожи, поэтому это важно делать. Однако помните, что подобные процедуры следует выполнять только в стерильных условиях кабинета при клинике или салоне, для того чтобы были полностью соблюдены все правила асептики и антисептики.
Механическая чистка осуществляется с помощью специальных инструментов (ложечек уна, петель, иголочек), которыми вскрывают закрытые комедоны, а также очищения, позволяющего снять роговой слой кожи, при этом используют кислоты или брашинг (очищение кожи щеточками различной жесткости), после чего наносят увлажняющую или питательную маску с антисептическим эффектом.
Ультразвуковая чистка проводится специальным аппаратом, в основе работы которого лежат высококочастотные механические колебания. Этот прибор оснащен специальным скрабером (лопаткой), которым косметолог водит по лицу и ультразвуковые волны очень мягко, но качественно, выталкивают все загрязнения, хорошо очищают кожу и поры (метод особенно эффективен в отношении открытых комедонов, черных точек). После такой обработки также наносят маску для профилактики воспаления и питания кожи лица.
Домашний ультразвуковой прибор для чистки лица сегодня легко можно купить в любом интернет-магазине. Однако стоит серьезно отнестись к такой покупке, знать для какой кожи он подходит и как правильно им пользоваться. Уточните у вашего косметолога, может ли конкретный прибор быть вам полезным.
Атравматичная чистка. Также применяется метод чистки кожи, при котором не применяются ни аппараты, ни инструменты, ни руки, а все делается исключительно препаратами. В состав таких процедур входит 12-15 этапов и каждый включает использование одного средства. Например, первый этап очищает лицо, второй распаривает кожу и расширяет поры, следующий этап выводит содержимое пор, затем применяется ухаживающая маска, далее этап, закрывающий поры, питание, увлажнение и завершается процедура особым припудриванием кожи для профилактики воспаления. Этот тип чисток выполняется только специальными профессиональными препаратами.
Количество процедур подбирается индивидуально и зависит от многих факторов. Самая физиологичная — это 1 раз в три-четыре недели. По необходимости проводится интенсивный курс — 4-6 процедур раз в неделю, а потом поддерживающие чистки раз в месяц.
Чистка HydraFacial — излюбленный метод чистки лица самых требовательных пациентов. Эта аппаратная процедура позволяет не только качественно очищать кожу, но питать ее и увлажнять. При проведении используются специальные отшелушивающие насадки. Они избавляют кожу от загрязнений и омертвевших клеток, и наносят сыворотки с мощным антиоксидантным действием. Все насадки одноразовые, каждая упакована в отдельный блистер и вскрывается при пациенте. Это позволяет соблюдать асептику и сводит риск инфицирования к нулю. Технология метода признана эффективной в мире профессиональной косметологии. Самое важное, что в клиниках она пользуется особой популярностью, так как комбинируется со всеми передовыми технологиями.
Так, например, есть программа «Выход в свет», когда мы делаем комплексный уход за кожей лица: лимфодренаж, потом эксфолиацию, очищение специальной сывороткой, потом проводим глубокое очищение, гликолевый пилинг — все это делается аппаратом. Затем делаем ревитализацию кожи, глубокое увлажнение и антиоксидантную терапию специальными средствами. В результате получаем гладкую чистую кожу, ровный цвет лица, хорошую текстуру кожи. При этом нет никакого периода восстановления, происходит стимуляция обновления кожи на клеточном уровне, мощное увлажнение и лифтинг, снятие отечности и усталости. После такой процедуры ощущается приятная свежесть и обновленность. Такой уход часто используется перед деловыми встречами и важными мероприятиями, когда нужно снять следы усталости. Также эти программы применяются для подготовки кожи к пластической операции.
Какую чистку лица вы бы не хотели сделать, качественно и безопасно ее можно провести только в условиях медицинского кабинета. Домашний уход должен включать регулярное очищение кожи, увлажнение и питание подходящими средствами, а специализированные программы лучше доверить врачу-косметологу.
Фибробласты и влияние на них препарата Meso–Wharton P199™: экспериментальные исследования
С. Г. Морозов, доктор мед. наук, член-корреспондент РАН, профессор, ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, ГБОУ ДПО Российская медицинская Академия последипломного образования
Е. Н. Волкова, доктор мед. наук, профессор, врач-дерматовенеролог, директор Научно-образовательного департамента «Премьер Фарм»
И. Н. Сабурина, доктор биол. наук, ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, ГБОУ ДПО Российская медицинская Академия последипломного образования
И. М. Зурина, младший науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии
Н. В. Кошелева, канд. биол. наук, ведущий науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, Биологический факультет Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова
А. А. Горкун, канд. биол. наук, ведущий науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии
К. В. Кожина, врач-косметолог, сертифицированный тренер «Премьер Фарм»
Введение
Старение – сложный биологический процесс, характеризующийся структурными, функциональными и обменными изменениями клеточных структур тканей. В отличие от внутренних органов, старение которых происходит достаточно скрытно, признаки этого процесса на коже всегда заметны.
Патоморфологически старение кожи характеризуется уменьшением ее толщины, снижением количества фибробластов, их размеров, скорости пролиферации, сглаживанием дермально-эпидермальной границы. Снижение синтетической активности клеток дермы приводит к уменьшению продукции ими таких важных компонентов основного вещества дермы, как коллагены, гликозаминогликаны, фибронектин и эластин (1, 2).
В настоящее время существует ряд препаратов для коррекции возрастных изменений кожи на клеточном уровне. К используемым препаратам предъявляются строгие требования: они должны быть безопасны, не аллергенны, эффективны, рентабельны, удобны в применении. Этим высоким требованиям отвечает инъекционный препарат Meso-Wharton P199™, предназначенный для интенсивной «репарации» кожи. Ключевой компонент препарата – Wharton Jelly Peptide P199 (P199) – синтетический аналог эмбрионального пептида, именно этот пептид инициирует глубокие, стойкие антивозрастные и регенерационные эффекты в коже.
Для подтверждения anti-age эффективности Meso-Wharton P199™ могут быть использованы разные объекты исследования – культуры клеток: кератиноциты, эндотелиальные клетки, меланоциты и дермальные фибробласты человека (3). Дермальные фибробласты представляют собой гетерогенную клеточную популяцию мезенхимного ряда и играют ключевую роль в регуляции процессов гомеостаза и восстановления кожного покрова. Они формируют оптимальные условия для пролиферации и функционирования других типов клеток (кератиноцитов, эндотелиальных, клеток волосяных фолликулов), регулируя клеточные взаимодействия (4, 5). Фибробласты продуцируют проколлаген, фибронектин, проэластин, гликозаминогликаны и ламинин, участвуют в формировании базальной мембраны кожи, продуцируют и выделяют в межклеточное пространство цитокины и факторы роста (6, 7). Также фибробласты играют важную роль в процессах эпителизации и заживления ран (8, 9). Поэтому они являются основной мишенью воздействия активных веществ, направленных как на омоложение кожи, так и на ее репарацию (10, 11).
Известно, что при длительном культивировании фибробластов происходит репликативное старение культуры. Старение культуры фибробластов in vitro максимально близко отражает изменения, присущие старению кожи in vivo. Вместе с тем последние исследования показали, что при длительном культивировании в монослое клетки теряют не только способность синтезировать белки внеклеточного матрикса, но и возникает риск накопления в клетках хромосомных аберраций (12). Кроме того, культивирование клеток в монослое не является естественным, изменяет характеристики клеток и не отражает реальные механизмы функционального состояния соматических клеток. При длительном культивировании в монослое клетки теряют одно из важнейших свойств своей функциональной активности – эпителио-мезенхимо-эпителиальную пластичность (13, 14, 15). 3D-культура (сфероиды) по своим свойствам более полно повторяет нативную ткань по плотности клеток на единицу объема и представляет собой динамичную систему с организованным клеточным поведением – необходимым условием полноценного морфогенеза.
Цель нашего исследования заключалась в комплексном, многоплановом изучении влияния препарата Meso–Wharton P199™ как на 2D-, так и в 3D-культурах дермальных фибробластов человека.
Материалы и методы
Первичную культуру дермальных фибробластов получали из биоптатов кожи посредством механической дезагрегации и последующей ферментативной обработки. Для этого биоптат промывали фосфатно-солевым буфером, содержащим антибиотик (гентомицин) и обрабатывали раствором трипсина. Затем пипетировали, в результате чего освобождали клетки от матрикса, центрифугировали, отмывали от раствора трипсина и ресуспендировали в культуральной среде DMEM/F12, содержащей 10 % сыворотки. Высевали на чашки Петри в плотности 1 × 105 – 2 × 105 клеток/см2 и помещали в стандартные условия инкубирования (+ 37 0С, 5 % СО2). Культивировали до 4-го пассажа, охарактеризовывали по экспрессии характерных маркеров и криоконсервировали, создавая банк первичной культуры дермальных фибробластов человека, на которой проводили все дальнейшие исследования. Использование в исследовании одной и той же первичной культуры клеток позволяет сопоставлять и сравнивать полученные данные.
Для получения «стареющей» культуры клетки из полученного ранее банка размораживали методом быстрого оттаивания при +37 0С, отмывали от остатков сыворотки и ДМСО раствором Хенкса с помощью центрифугирования в течение 7 мин. при 1000 g. Супернатант удаляли, полученный осадок из клеток ресуспендировали в полной ростовой среде, высевали на чашки Петри и помещали в стандартные условия инкубирования (+ 37 0С, 5 % СО2). Культивировали до 18-го пассажа, когда становились хорошо заметны все признаки репликативного старения дермальных фибробластов. Размороженная, не пассированная культура клеток 4-го пассажа (Р4) считалась контрольной и соответствовала по своим характеристикам фибробластам молодой кожи.
Для исследования дозозависимости препарата Meso-Wharton P199™ на 2D-культуре аликвоты (500 мкл) пептида P199, растворенного в солевом буфере, смешивали с полной ростовой средой в соотношении 1:2, 1:10, 1:100, 1:1000. Анализ цитотоксичности проводили на 2D-культуре дермальных фибробластов 18-го пассажа (Р18). Клетки помещали на 12-луночные планшеты в плотности 10 000 клеток на лунку. В качестве контроля исследовали поведение клеток в полной ростовой среде без добавления пептида. Клетки культивировали в присутствии пептида в течение 72 ч., далее окрашивали растворами Hoechst 33258 (0,004 мг/мл) и йодида пропидия PI (0,001 мг/мл), с помощью которого оценивали жизнеспособность клеток по проникновению в их ядро PI под инвертированным флуоресцентным микроскопом Olympus CKX41 (Olympus, Япония).
Анализ биоактивности проводили на 2D-культуре дермальных фибробластов и помещали на покровные стекла в чашки Петри (35 мм). Исследовали морфологию клеток и экспрессию характерных для фибробластов маркеров: цитокератина 19, эластина, α-гладкомышечного актина (αSMA), PCNA (маркера пролиферации), коллагенов I, III и IV типов. В качестве контроля культивировали клетки 18-го пассажа в полной ростовой среде без добавления препарата. Для проведения иммуноцитохимического анализа клетки культивировали в присутствии пептида в течение 72 ч., далее фиксировали в 4 % растворе параформальдегида (4 0С, 20 мин.). Затем стекла инкубировали с первичными антителами к цитокератину 19, эластину, α-гладкомышечному актину (αSMA), PCNA (маркеру пролиферации), коллагенам I, III и IV. Результат визуализировали с помощью вторичных антител, конъюгированных с флуорохромами FITC (E=525 nm) и DyLight594 (E=617 nm). Ядра докрашивали раствором Hoechst 33258 (0,004 мг/мл). Анализ проводили с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Olympus Fluoview FV10 (Olympus, Япония).
Для изучения влияния препарата Meso-Wharton P199™ на образование сфероидов из дермальных фибробластов исследовали монослойные клеточные культуры фибробластов Р18, которые культивировали с добавлением в ростовую среду препарата Meso–Wharton P199™ и культуры фибробластов Р18, культивируемые без добавления препарата Meso-Wharton P199™. Для данного этапа исследования использовали аликвоты (500 мкл) пептида р199, растворенного в солевом буфере, и смешаные с полной ростовой средой в соотношении 1:10. Фибробласты культивировали в течение 72 ч., отмывали от ростовой среды раствором Версена, затем обрабатывали 0,25 % раствором трипсина и снимали с чашек. Подсчитывали количество клеток в суспензии и центрифугировали. Осадок ресуспендировали в полной ростовой среде и помещали на агарозные планшеты в концентрации 1 × 103 клеток в лунку. Агарозные планшеты помещали в 12-луночные культуральные планшеты и вели прижизненное наблюдение в стандартных условиях камеры прибора Cell-IQ (СМ Technologies, Финляндия) в течение семи дней. Фоторегистрацию осуществляли каждые 20 мин. с помощью программы Cell-IQ Imagen, обработку изображений проводили в программном пакете Cell-IQ Analyzer. Положительным контролем считали формирование сфероидов из фибробластов 4-го пассажа (Р4) в полной ростовой среде без добавления пептида.
Результаты и обсуждение
В культуре дермальных фибробластов 18-го пассажа, которые использовали для дальнейших исследований как стареющую, были хорошо заметны все признаки репликативного старения: спонтанное увеличение размера клеток, преобладание крупных плащевидных и парусовидных клеток (Рис. 1а). Темпы клеточного деления резко снижались. Контрольная культура (Р4) соответствовала по своим характеристикам фибробластам молодой кожи. В ней преобладали небольшие веретеновидные клетки, которые хорошо пролифелировали (Рис. 1б).
Рис. 1. Культуры дермальных фибробластов, используемые для дальнейшего исследования.
а – опытная культура фибробластов (Р18) – соответствует зрелой (стареющей) кожи;
б – контрольная культура фибробластов (Р4) – соответствует молодой коже
По экспрессии характерных для фибробластов маркеров культура 18-го пассажа (Р18) также соответствовала возрастным изменениям, наблюдаемым в коже in vivo. Контрольные клетки активно экспрессировали характерные для фибробластов маркеры (цитокератина 19, эластина, коллагенов I, III и IV типов), отвечающие за основные биомеханические свойства кожи, такие как гладкость, упругость, эластичность (Рис. 2а, б, в), а в опытной культуре (Р18) экспрессия маркеров заметно снижалась по сравнению с контрольной культурой (Рис. 3а, б, в).
Рис. 2. Контрольная культура фибробластов (Р4)
а – экспрессия маркеров цитокератина-19, эластина;
б – экспрессия маркеров коллагена III типа;
в – экспрессия маркеров коллагена I типа
Рис. 3. Опытная культура фибробластов (Р18)
а – экспрессия маркеров цитокератина-19, эластина;
б – экспрессия маркеров коллагена III типа;
в – экспрессия маркеров коллагена I типа
Результаты исследования дозозависимости препарата Meso-Wharton P199™ на 2D-культуре показали, что предлагаемые разведения 1:10, 1:100 и 1:1000 не оказывали цитотоксического действия на культуру дермальных фибробластов человека. Учитывая отсутствие морфологических и цитотоксических различий эффекта препарата при разведениях, для исследования биоактивности препарата Meso-Wharton P199™ использовали разведение: 1:10.
Эластин, объем которого составляет всего 2 % от общего объема белков дермы, наряду с коллагеновыми волокнами придает ей упругость и эластичность. К 50-летнему возрасту в большинстве эластических волокон наблюдаются дегенеративные изменения за счет снижения синтеза эластина фибробластами. Поэтому экспрессия фибробластами эластина является одним из основных маркеров старения кожи.
Коллаген – фибриллярный секреторный белок, наиболее распространенный в организме человека. Он образует волокна, переплетающиеся как нити в ткани. Коллаген и эластин формируют волокнистый каркас, в который могут врастать новые клетки, и обеспечивают коже упругость и эластичность, а нарушение их синтеза приводит к потере этих свойств. По морфологии коллаген принято делить на три группы: фибриллярный коллаген: коллагены I, II, III, V типов; сетевидный коллаген – коллаген IV типа, образующий опорную сеть базальных мембран; нитевидный коллаген – коллаген VI типа.
В дерме взрослого человека интерстициальный фибриллярный коллаген (I и III типы) является самой большой фракцией коллагена и составляет 70 % от сухой массы дермы. При этом содержание коллагена I типа составляет 80 %, а III типа – приблизительно 15 % от всего объема коллагена. На протяжении всей жизни человека содержание коллагенов уменьшается примерно на 1 % в год.
Иммуноцитохимическое окрашивание на характерные для фибробластов маркеры в нашем исследовании показало, что экспрессия цитокератина-19 и эластина в культуре дермальных фибробластов человека Р18, отвечающих за упругость и эластичность кожи, увеличивается после сокультивирования с препаратом Meso-Wharton P199™, по сравнению с контрольной группой (Рис. 4а, б, в).
Монослойные клеточные культуры являются признанной модельной системой, используемой в разработке и исследованиях лекарственных средств. Однако такая 2D-клеточная модель отличается от естественных условий. Обычная адгезивная культура представляет собой растущие двумерным (2D) монослоем клетки на плоской поверхности. Клетки, прикрепленные к искусственной пластиковой или стеклянной подложке, контактируют с другими клетками с образованием межклеточных контактов только в одной плоскости, что препятствует формированию многомерной структуры. Все органы и ткани, включая кожу, имеют трехмерную клеточную организацию, в которой клетки взаимодействуют друг с другом, образуя сложные комплексы контактов с другими клетками и внеклеточным матриксом, формируя таким образом уникальное микроокружение. Поэтому «старение» монослойной культуры фибробластов in vitro во многом сходно, но неполностью эквивалентно старению кожи in vivo. Воспроизвести все возрастные изменения на монослойной культуре в полном объеме не удается. Это приводит исследователей к переводу модельных систем из 2D- в 3D-условия культивирования. Одним из вариантов 3D-клеточных культур являются сфероиды. Они представляют собой трехмерные самоорганизующиеся в силу природных адгезивных свойств сферические кластеры клеток. При формировании сфероидов клетки могут восстановить межклеточные контакты и создать микроокружение, поддерживающее их нативный фенотип. Однако не все клетки могут образовывать сфероиды. Низкодифференцированные клетки человека, включая «незрелые» фибробласты, в условиях отсутствия адгезии способны агрегировать друг с другом, формируя новую многоклеточную структуру – сфероид, содержащий эпителиальный и мезенхимный компоненты. Стареющие культуры фибробластов способность к сфероидообразованию утрачивают. Для сфероидообразования важен определенный уровень экспрессии фибронектина и интегринов α5 и β1 фибробластами. Дифференцировка и последующее старение клеток сопровождаются утратой способности к мезенхимо-эпителиальному переходу, без которого невозможно формирование сфероидов. Таким образом, сфероидообразование является уникальной простой количественной тестовой системой для определения клеточной зрелости и оценки влияния на нее исследуемых препаратов.
Кроме того, 3D-клеточные культуры более стабильны, чем 2D-клеточные культуры. Их можно поддерживать в культуре в течение длительного времени – более 3 месяцев, в отличие от монослойных культур, которые быстро достигают конфлуентного состояния и требуют постоянного пересева или при отсутствии пролиферации («старые» культуры) погибают. Поэтому именно 3D-культуры стали активно использовать при изучении отсроченных эффектов лекарственных препаратов.
На рис. 5 представлена сборка отдельных фотографий на сроках: 12 часов, 24 часа, 3, 5 и 7 суток. Видно, что при сокультивировании культуры фибробластов Р18 с препаратом Meso–Wharton P199™, смешанного с ростовой средой, уже через 12 часов наблюдается образование рыхлого сфероида. В течение последующих дней происходит компактизация клеток и уплотнение сфероида, которое заканчивается к 7 суткам культивирования. В отличие от сфероидов, образованных из фибробластов Р4, размеры образованных сфероидов из фибробластов Р18 через 7 суток немного больше, даже после компактизации. Вероятно, это связано с большим размером клеток в культуре фибробластов Р18. Из культуры фибробластов Р18, культивированных без пептида, через 12 часов образуется рыхлый агрегат, который при дальнейшем культивироании не компактизуется, а остается рыхлым с темной некротической зоной внутри сфероида и рыхлым наружным слоем, состоящим из дебриса. Возможно, клетки не могут синтезировать достаточное количество внеклеточного матрикса для образования межклеточных контактов и последующего образования сфероида.
Рис. 5. Влияние препарата Meso–Wharton P199™ на образование сфероидов из дермальных фибробластов в условиях 3D-культивирования. Световая фазово-контрастная прижизненная цейтраферная микроскопия
Исследование способности образовывать сфероиды показало, что присутствие в ростовой среде препарата Meso-Wharton P199™ стимулирует «омоложение» клеток и последующее восстановление мезенхимо-эпителиальной пластичности культивированных фибробластов за счет восстановленной способности синтезировать в достаточном для установления межклеточных контактов количестве компонентов внеклеточного матрикса (фибронектина и коллагенов), что влияет на способность формировать сфероиды. Результаты иммуноцитохимического исследования сформированных сфероидов, представленные далее, подтвердили наше предположение по восстановлению экспрессии компонентов внеклеточного матрикса. Было показано, что в сфероидах, культивированных в ростовой среде с добавлением препарата, практически все клетки экспрессировали эластин (Рис. 6а, б, в), а поверхностные клетки активно экспрессировали цитокератин-19 –белки внеклеточного матрикса, поддерживающие упругость кожи (Рис. 7а, б, в).
Рис. 6. Экспрессия эластина
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4 (контроль)
Рис. 7. Экспрессия цитокератина-19
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4 (контроль)
Препарат не оказывал ключевого влияния на экспрессию коллагенов I и III типов. Практически все клетки сфероидов экспрессировали эти коллагены. Однако при исследовании влияния на экспрессию коллагена IV типа было обнаружено, что после сокультивирования с препаратом р199 практически все клетки в сфероиде экспрессировали этот коллаген. Очевидно, анализируемый препарат активно стимулирует в фибробластах выработку коллагена IV – основного компонента базальной мембраны эпидермиса, дефицит которого приводит к старению кожи и развитию в ней патологических процессов (Рис. 8а, б, в). Также было установлено, что препарат 199 положительно влияет на уровень экспрессии фибронектина (Рис. 9а, б, в), который вместе с гликозаминогликанами составляют аморфный (основной) компонент межклеточного матрикса. Кроме того, фибронектин отвечает за адгезию, подвижность, дифференцировку и взаимную ориентацию клеток (6).
Рис. 8. Экспрессия коллагена IV типа
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso-Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4
Рис. 9. Экспрессия фибронектина
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso-Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4
Заключение
Результаты данного исследования убедительно продемонстрировали эффективность применения препарата Meso-Wharton P199™ для омоложения кожи.