что включает в себя технология directed evolution
Игра в Бога
Нобелевскую премию по химии 2018 года присудили за эволюцию в пробирке
Нобелевская премия по химии в 2018 году была присуждена за разработку методов направленной эволюции ферментов, пептидных последовательностей и антител. Награду разделят между собой Фрэнсис Арнольд (Frances H. Arnold), Джордж Смит (George P. Smith) и сэр Грегори Винтер (Sir Gregory P. Winter). Фрэнсис Арнольд получила премию за разработку метода направленной эволюции ферментов, а два других ученых — за создание метода фагового дисплея пептидов и антител.
Методы, за разработку которых присудили Нобелевскую премию по химии в 2018 году, используются для синтеза в лабораторных условиях различных типов белков с нужными свойствами — каталитической активностью, способностью связываться с теми или иными веществами и клетками или диапазоном условий, в которых эти белки работают. Оба разработанных подхода основаны на том, что структура белков, которые синтезируются в живых организмах, кодируется последовательностью нуклеотидов в генах. С помощью механизмов транскрипции и трансляции последовательность нуклеотидов на определенном участке молекулы ДНК преобразуется в последовательность аминокислот, в результате чего синтезируется белок с определенной первичной структурой, который принимает нужную форму и выполняет в организме те или иные функции.
Соответственно, если слегка нарушить последовательность нуклеотидов в ДНК, изменив пару азотистых оснований, то можно повлиять и на структуру белков, которые они кодируют, изменив при этом их физические и химические свойства. В естественных условиях подобные изменения в последовательности нуклеотидов происходят за счет случайных мутаций — изменений генома под влиянием внешних условий, например за счет ошибок во время репликации ДНК. Именно эти ошибки приводят к эволюции живых организмов: в структуре гена накапливаются небольшие изменения, после чего естественным образом отбираются наиболее выгодные с точки зрения дальнейшего развития вида варианты.
В процессе естественной эволюции выбор наиболее эффективных белков и соответствующих им генов может занимать очень длительное время, охватывающее жизнь множества поколений. Но для того, чтобы аналогичный подход можно было использовать для направленного синтеза белков с заданными свойствами в лабораторных условиях, его хочется проводить намного быстрее. Изначально для направленного синтеза белков на основе ДНК ученые пытались вносить изменения в структуру молекулы в известных местах на основе теоретических предсказаний. Однако как именно точечные замены азотистых оснований повлияют на функции белка, предсказать заранее практически невозможно, поэтому такой подход оказался не слишком эффективным.
Направленная эволюция
В 1993 году Фрэнсис Арнольд предложила альтернативный подход. Она показала, что изменение структуры гена, отвечающего за синтез определенного белка, можно проводить не точечно, а наоборот — получая множество вариантов гена с небольшими изменениями в случайных местах. Сейчас для этого чаще всего используют полимеразную цепную реакцию с повышенной вероятностью мутаций — процесс многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью ДНК-полимеразы. В результате этого процесса образуется множество копий исходного гена, и структура многих из них из-за случайных мутаций совсем незначительно отличается от структуры исходной молекулы. Все эти гены кодируют практически такой же белок, как и ДНК с изначальной последовательностью нуклеотидов, однако его свойства все же немного отличаются. В наборе всех этих многочисленных модификаций — библиотеке генов — содержатся молекулы, которые кодируют как более эффективные ферменты, так и менее эффективные.
Основная трудность после создания такой библиотеки — отобрать из нее именно те гены, которые соответствуют наиболее эффективным — с точки зрения дальнейшего применения — белкам. Для этого было предложено использовать сравнительно маленькие библиотеки, которые поэтапно обогащались «полезными» вариантами за счет отбора после каждого раунда мутагенеза. Этот процесс, по сути, повторяет эволюцию, и на каждом этапе отбирается тот ген, который кодирует более эффективный белок.
«Вы до некоторой степени играете в Бога и в эволюцию, — комментирует этот подход Константин Северинов, профессор Сколтеха и университета Ратгерса. — Эволюция по Дарвину тоже происходит совершенно ненаправленно, все изменения случаются без оглядки на результат, случайно, а потом отбор находит в имеющемся разнообразии то, что нам нужно в данной ситуации. В эксперименте вы просто резко увеличиваете скорость накопления мутаций, а дальше отбираете как вам хочется».
Теоретическую возможность подобного метода еще в 1984 году предсказал Манфред Эйген (тоже Нобелевский лауреат), однако реализовать его в эксперименте впервые удалось именно Фрэнсис Арнольд в 1993 году. В своей работе она синтезировала субтилизин E — фермент из класса гидролаз. В результате четырех стадий мутагенеза ей удалось увеличить его активность в 250 раз по сравнению с изначальной модификацией.
Предложенная методика включала в себя следующие основные стадии. Сначала определяются те ферменты, которые лучше всего подходят для возможной эволюции. Затем для них составляются библиотеки генов, после чего разрабатываются критерии, по которым определяется нужная динамика характеристик фермента (например, Арнольд смотрела, насколько быстро протекает гидролиз казеина под действием фермента). Те ДНК, которые производят «хорошие» белки, сохраняются, а те, которые приводят к синтезу ферментов с ухудшенными свойствами, — выкидываются. Затем отобранные ДНК подвергаются следующей стадии мутагенеза, и создается новая библиотека. Повторяя эту процедуру несколько раз, можно добиться получения фермента с требуемыми свойствами.
Принципиальная схема метода направленной эволюции ферментов