Бациллус мегатериум что это
В 1960-х годах, до использования Bacillus subtilis для этой цели, B. megaterium была основным модельным организмом среди грамположительных бактерий для интенсивных исследований биохимии, споруляции и бактериофагов. В последнее время его популярность в области биотехнологии начала расти из-за его способности производить рекомбинантный белок.
СОДЕРЖАНИЕ
Характеристики
Изоляция
Описанный метод может быть использован для выделения штаммов B. megaterium из почвы. Процедура начинается с посева 0,1 мл разведенных суспензий термообработанной почвы на агар с минеральной основой глюкозы: 10 г Glc ; 1 г (NH 4 ) 2 SO 4 или KNO 3 ; 0,8 г K 2 HPO 4 ; 0,2 г KH 2 PO 4 ; 0,5 г MgSO 4 · 7H 2 O; 0,05 г CaSO 4 · 7H 2 O; 0,01 г FeSO 4 · 7H 2 O; 12 г агара; вода дистиллированная до 1 литра; отрегулировать pH 7,0. Планшеты инкубируют при 30 ° C. Белые, круглые, гладкие и блестящие колонии диаметром 1–3 мм могут развиваться на нитратной (KNO 3 ) среде за 36–48 часов. Однако не все штаммы могут использовать нитрат, поэтому рекомендуется использовать среду аммония ((NH 4 ) 2 SO 4 ) параллельно. Колонии обнаруживаются по их внешнему виду, и подозреваемых следует наблюдать под микроскопом на наличие обычно крупных клеток этого вида.
История названия
Имя B. megaterium является именительным падежом в приложении (см. Правило 12 IBCN) и образовано от греческого прилагательного мега ( μέγας, μεγάλη, μέγα ), означающего «великий», и второго слова неясной этимологии. Возможны три гипотезы эпитета мегатерий:
Следовательно, в первом юридическом заключении Бактериологического кодекса было решено, что название должно оставаться «мегатериум», учитывая неясное значение.
Этимология, перечисленная в LPSN, несмотря на то, что она не совсем верна, представляет собой сплав первой и третьей интерпретации Gr. прил. мегас, большой; Gr. п. терас-атис, чудовище, зверь; NL n. мегатериум, большой зверь.
Геномный и фенотипический потенциал антимикробной активности штамма бактерии Bacillus megaterium В-4801
УДК 579.62:579.852.11:615.33:575.113
doi: 10.15389/agrobiology.2020.4.816rus
Генетические детерминанты штаммов бактерий Bacillus sp., определяющие возможность биосинтеза разнообразных антимикробных соединений, представляют особый научный интерес, поскольку благодаря им эти микроорганизмы нашли широкое применение в качестве основы пробиотиков. Важный этап системного анализа механизмов пробиотического действия, в частности антимикробной активности микроорганизмов, — реконструкция его метаболической карты, то есть сбор и визуализация всех потенциально возможных процессов в клетке. В представленной работе впервые описаны потенциально заложенные генетические механизмы синтеза ряда биологически активных веществ у выделенного нами ранее штамма бактерии Bacillus megaterium В-4801, в частности возможность синтезировать каносамин — бактериоцин, относящийся к группе аминогликозидов, который может выполнять важную роль в реализации пробиотических свойств благодаря выраженной антимикробной активности. Нашей целью было изучение антимикробной активности штамма Bacillus megaterium В-4801 в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий, а также поиск генов, связанных с антимикробной активностью, на основе полногеномного секвенирования. Штамм B. megaterium В-4801, депонированный в коллекции ООО «БИОТРОФ+», обладает выраженной пробиотической активностью. Антимикробную активность в отношении Staphylococcus aureus, Candida tropicalis, Clostridium sp., Escherichia coli оценивали методом отсроченного антагонизма (метод «колодцев»). Библиотеку ДНК для полногеномного секвенирования готовили с помощью набора Nextera XT («Illumina, Inc.», США). Нуклеотидные последовательности определяли с использованием прибора MiSeq («Illumina, Inc.», США) и комплекта реактивов MiSeq Reagent Kit v3 (300-cycle) («Illumina, Inc.», США). Недостоверные последовательности и адаптеры удаляли с помощью программы Trimmomatic-0.38. Отфильтрованные по длине не менее от 50 до 150 п.н. парноконцевые последовательности собирали de novo с использованием геномного сборщика SPAdes-3.11.1. Функциональную аннотацию генома проводили в программах PROKKA 1.12 и RAST 2.0. Оценку пула генов, связанных с антимикробной активностью, и построение метаболической карты выполняли с помощью базы данных KEGG Pathway (http://www.genome.jp/kegg/). Культуральными методами была выявлена антагонистическая активность B. megaterium В-4801 в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Зоны задержки роста тест-штаммов составляли от 2±0,15 до 25±1,4 мм. Геном штамма B. megaterium В-4801 был представлен одной кольцевой хромосомой размером 6 113 972 п.н., содержащей 37,5 % ГЦ-пар. Показано, что более 45 % генов B. megaterium В-4801 вовлечены в функции транспорта и метаболизма аминокислот, транскрипции, трансляции, транспорта и метаболизма углеводов, белков. Определены ключевые генетические локусы, детерминирующие синтез антимикробных метаболитов. В составе генома секвенированного штамма локализованы гены (FabD, FabF, FabG, FabZ, FabI и др.), связанные с продукцией белков, участвующих в синтезе алифатических ненасыщенных карбоновых кислот с числом углеродных атомов от 3 до 18, в частности масляной, капроновой, каприловой, каприновой, лауриновой, миристиновой, пальмитиновой, стеариновой, олеиновой. Согласно имеющимся сведениям, все эти вещества обладают выраженными антимикробными свойствами. Кроме того, нами обнаружен целый кластер генов (Asm22-24, Asm43-45, Asm47), связанных с биосинтезом бактериоцина каносамина, который относится к группе аминогликозидов, а также поликетидных ансамициновых антибиотиков из группы макролидов. Установленный пробиотический потенциал свидетельствует о роли исследованного штамма как потенциального кандидата в качестве основы для пробиотиков, в том числе для использования в животноводстве. Проведенный геномный анализ выявил новые системы оперонов, контролирующих метаболические пути синтеза антимикробных веществ, ранее не описанные для B. megaterium.
Ключевые слова: полногеномное секвенирование, Bacillus megaterium, биосинтез жирных кислот, бактериоцины, антимикробная активность, каносамин, ансамициновые антибиотики, пробиотики.
GENOMIC AND PHENOTYPICAL POTENTIAL OF ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF A BACILLUS STRAIN Bacillus megaterium В-4801
G.Yu. Laptev, E.A. Yildirim, T.P. Dunyashev, L.A. Ilyina, D.G. Tyurina, V.A. Filippova, E.A. Brazhnik, N.V. Tarlavin, A.V. Dubrovin, N.I. Novikova, V.K. Melikidi, S.N. Bikonya.
A b s t r a c t
The genetic determinants of bacterial strains Bacillus sp., which determine the possibility of biosynthesis of various antimicrobial compounds, are of particular scientific interest, since thanks to them these microorganisms are widely used as the basis of probiotics. An important stage in the systemic analysis of the mechanisms of probiotic action, in particular the antimicrobial activity of microorganisms, is the reconstruction of its metabolic map, that is, the collection and visualization of all potential cell processes. In this work, for the first time, the potentially inherent genetic mechanisms for the synthesis of a number of biologically active substances in the bacterial strain Bacillus megaterium are described, in particular, the possibility of synthesizing canosamine, a bacteriocin belonging to the aminoglycoside group, which can play an important role in the implementation of probiotic properties due to its pronounced antimicrobial activity. Our goal was to study the antimicrobial activity of the strain Bacillus megaterium B-4801 against pathogenic and opportunistic bacteria, as well as to search for genes associated with antimicrobial activity based on whole genome sequencing. The B. megaterium B-4801 strain deposited in the collection of OOO BIOTROF+, possesses a pronounced probiotic activity. Its antimicrobial activity against Staphylococcus aureus, Candida tropicalis, Clostridium sp., and Escherichia coli was assessed by the method of delayed antagonism using wells. A DNA library for whole genome sequencing was generated using Nextera XT kit (Illumina, Inc., USA). Nucleotide sequences were determined using a MiSeq instrument (Illumina, Inc., USA) and MiSeq Reagent Kit v3 (300-cycle) (Illumina, Inc., USA). Invalid sequences and adapters were removed using the Trimmomatic-0.38 program. Filtered in length from 50 to 150 bp pair-terminal sequences were assembled de novo using genomic assembler SPAdes-3.11.1. Functional annotation of the genome was performed with PROKKA 1.12 and RAST 2.0 programs. The pool of genes associated with antimicrobial activity was assessed and the metabolic map was constructed using the KEGG Pathway database (http://www.genome.jp/kegg/). The antagonistic activity of B. megaterium B-4801 against pathogenic and opportunistic microorganisms was revealed by cultural methods. The growth inhibition zones of the test strains ranged from 2±0.15 to 25±1.4 mm. The genome of the B. megaterium B-4801 strain is a single circular chromosome with a size of 6,113,972 bp, containing 37.5 % GC pairs. More than 45 % of B. megaterium B-4801 genes are involved in the transport and metabolism of amino acids, transcription, translation, transport and metabolism of carbohydrates and proteins. The key genetic loci that determine the synthesis of antimicrobial metabolites have been identified. The sequenced genome of the strain contains genes (FabD, FabF, FabG, FabZ, FabI, etc.) associated with the production of proteins involved in the synthesis of aliphatic unsaturated C3-C18 carboxylic acids, in particular, butyric, nylon, caprylic, capric, lauric, myristic, palmitic, stearic, oleic. According to the information accumulated by world science, all these substances have pronounced antimicrobial properties. The whole-genome sequencing also discovered a cluster of genes (Asm22-24, Asm43-45, and Asm47) associated with the biosynthesis of bacteriocin kanosamin, which belongs to the aminoglycoside group, and polyketide ansamycin antibiotics from the macrolide group. The established probiotic potential indicates the role of the investigated strain as a potential probiotic candidate, in particular for use in animal husbandry. The performed genomic analysis revealed new systems of operons that control the 827 metabolic pathways for the synthesis of antimicrobial substances, which were not previously described for B. megaterium.
Keywords: whole-genome sequencing, Bacillus megaterium, acid biosynthesis, bacteriocins, antimicrobial activity, canosamine, ansamycin antibiotics, probiotics.
Bacillus Megaterium: продуцент аминокислот и пробиотик для сельскохозяйственных животных (обзор)
В индустрии кормов и кормовых добавок для сельскохозяйственных животных активно применяются различные направления микробиологического синтеза. Более 50 лет промышленное производство аминокислот осуществляется при помощи биотехнологий, ежегодные темпы роста производства составляют 5–7 %. Аминокислоты получают промышленно в ходе ферментации с использованием высокоэффективных штаммов различных видов бактерий. По мере прогрессивного развития микробиологических технологий и изучения состава микрофлоры животных происходит открытие новых видов микроорганизмов-продуцентов полезных веществ, в т. ч. вида Bacillus megaterium, которые относятся к бактериям-полипродуцентам, т. к. их клетки способны нарабатывать множество веществ различной химической природы: аминокислоты, протеазы, антибиотики, пептиды, витамины, бактериоцины и ряд других соединений. Они обладают высокоэффективной системой синтеза и транспорта белков из клетки, растут на различных доступных и недорогих углеродных субстратах и непатогенны в отношении растений, животных и человека и не вырабатывают в среду щелочных протеаз. Bacillus megaterium стабильны в широком диапазоне рН и при воздействии высоких температур, и таким образом стабильно сохраняют свои свойства в ходе производственных циклов, а также при хранении и транспортировке получаемых продуктов. Затраты на выращивание Bacillus megaterium относительно невысоки, и при хорошем выходе продукта и относительно малой ресурсоемкости производства делает его экономически рентабельным. Пробиотики на основе Bacillus megaterium, а также штаммы бактерии с повышенным синтезом лимитирующих аминокислот – перспективные для индустрии кормления животных направления прикладного микробиологического синтеза.
Bacillus megaterium: amino acid producer and probiotic for farm animals (review)
Different directions of microbiological synthesis are actively used in the industry of feed and feed additives for farm animals. More than 50 years of industrial production of amino acids is carried out with the help of biotechnology and the annual growth rate of production is 5–7 %. Amino acids are produced industrially during fermentation using highly effective strains of different types of bacteria. With the progressive development of microbiological technologies and the study of the composition of animal microflora the discovery of new species of microorganisms-producers of useful substances including species Bacillus megaterium, which belong to the bacteria-polyproducts, because their cells are able to develop many substances of different chemical nature: amino acids, proteases, antibiotics, peptides, vitamins, bacteriocins and a number of other compounds. They have a highly efficient system of synthesis and transport of proteins from the cell, grow on a variety of affordable and inexpensive carbon substrates and are non-pathogenic to plants, animals and humans and do not produce alkaline proteases in the environment. Bacillus megaterium is stable in a wide range of pH and at high temperatures, and thus stably retain their properties during production cycles as well as during storage and transportation of the resulting products. The costs of growing Bacillus megaterium are relatively low and with a good yield and relatively low resource intensity of production make it economically viable. Probiotics based on Bacillus megaterium as well as strains of bacteria with increased synthesis of limiting amino acids are promising for the animal feeding industry directions of applied microbiological synthesis.
В современном животноводстве и кормлении животных практическая микробиология занимает значимую позицию. Различные направления микробиологического синтеза активно применяются в индустрии кормов и кормовых добавок. Так, например, уже более 50 лет промышленное производство аминокислот осуществляется при помощи биотехнологий, ежегодные темпы роста производства составляют 5‒7 %. В процессе микробиологического синтеза аминокислоты получают в ходе ферментации с использованием высокоэффективных штаммов различных видов бактерий, например Escherichia coli, как правило, на углеводных питательных средах из сахаров (патока, сахароза или глюкоза) [12]. Развитие рынка было особенно динамичным для лимитирующих кормовых аминокислот, которые добавляют в комбикорма сельскохозяйственных животных и птицы: метионин, лизин, треонин, триптофан, валин и др. По мере прогрессивного развития микробиологических технологий и изучения состава микрофлоры животных происходит открытие новых видов микроорганизмов-продуцентов полезных веществ. В их числе Corynebacterium glutamicum, Bacillus megaterium и др., на основе которых создаются кормовые добавки и пробиотики.
B. megaterium – палочковидные, грамположительные аэробные мезофильные спорообразующие бактерии рода Bacillus с широким ареалом обитания, галофильные. Открытие бактерии принадлежит Антону де Бари (1884 г.). Бактерия была названа megaterium (в пер. с греческого значит «большое животное») в связи со своим большим размером примерно в 100 раз больше, чем E. Coli длина палочек B. megaterium до 4 мкм, диаметр – до 1,5 мкм. Величина генома B. megaterium – 5,8 мегабаз, содержание Г+Ц (37,5 %), оптимум температуры – 30‒37°С.
В. megaterium вместе с некоторыми другими видами рода Bacillus, в т. ч. Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacillus brevis и Bacillus clausii образуют очень ценную с индустриальной точки зрения группу микроорганизмов. Они обладают высокоэффективной системой синтеза и транспорта белков из клетки, растут на различных доступных и недорогих углеродных субстратах (не строго специфичны к субстрату).
Бациллус мегатериум что это
Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3 для растениеводства в качестве средства для ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных и древесных культур.
В указанном способе бактерии выращивают на картофельной среде, высушивают и смешивают с порошкообразным каолином, служащим субстратом для сохранения спор высушенных бактерий. При использовании Фосфоробактерина происходит минерализация сложных фосфороорганических соединений, что приводит к повышению плодородия почвы.
Известны также зарубежные публикации, в которых описано использование бактерий вида Bacillus megaterium в качестве средства стимуляции роста растений и/или их корней (например, в патенте KR 20100963774 В1 от 14.06.2010 г. на штамм Bacillus megaterium KNUC 251 или в заявке США 20130014434, опубликованной 17.01.2013 г., в которой питательная композиция для корней пересаживаемого растения содержит в числе других микроорганизмов бактерии Bacillus megaterium) или в качестве средства для борьбы с болезнями растений (например, в патенте US 054035830, опубликованном 04.04.1995 г. на штамм Bacillus megaterium АТСС 55000 в качестве средства биологической борьбы с заболеваниями сои, вызванными грибом Rhizoctonia solani).
Известен также Патент РФ №2327737 с пр. 01.08.2006 г. на изобретение «Штамм бактерий Bacillus megaterium, мобилизующий фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчивый к полигексаметиленгуанидину», МПК C12N 1/20, C05F 11/08, C12R 1/11, опубликовано 27.06.2008 г.
Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и геохимии. Штамм Bacillus megaterium var. phosphaticum BKM В-2357Д способен выщелачивать фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчив к полигексаметиленгуанидину. Штамм может быть использован для получения бактериального препарата, повышающего приживаемость в почве и урожайность сельскохозяйственных культур, для рекультивации техногенно загрязненных земель, а также в биотехнологических работах в области геохимии.
Известен также штамм ризосферных бактерии Bacillus subtilis Ч-13, используемый в качестве средства для улучшения питания, ускорения роста и увеличения продуктивности овощных, зерновых и технических культур (патент РФ №2259397 с пр. 02.04.2003 г. ). Штамм бактерий Bacillus subtilis Ч-13 используют для производства микробиологического удобрения в торфяной форме «Бисолби», сухой форме «БисолбиФит» и жидкой форме «Экстрасол» (Свидетельство о гос.регистрации №0680-07-2018-216-0-0-0-1 от 29.03.2007).
Известен патент РФ №2558291 с пр. 24.12.2013 г. на изобретение «Полифункциональное средство для растениеводства», МПК C12N 1/20, A01N 63/00, опубликовано: заявка 27.062015 г., патент 27.07.2015 г. (прототип).
Описанный штамм споровых бактерий Bacillus megaterium 501 GR обладает ростостимулирующим эффектом, улучшает фосфорное питание растений, а также способствует биоремедиации загрязненных пестицидами почв. Использование штамма Bacillus megaterium 501 GR позволяет повысить продуктивность растений, а также защитить их от фитопатогенных грибов и микроорганизмов, вызывающих заболевания корней.
Задачей изобретения является выявление штамма, пригодного для использования в сельском и лесном хозяйстве в качестве средства для ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных и древесных культур, позволяющего расширить арсенал подобных средств.
Указанная задача решается за счет того, что в качестве средства для ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных и древесных культур в сельском и лесном хозяйстве используется штамм эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3.
Штамм эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3 был выделен из внутренних тканей черенков винограда (Vitus vinifera L.), сорта «Мускат черный» и депонирован 07.11.2016 г. в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (RCAM) в ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM 04324. Справка о депонировании штамма прилагается.
Среда культивирования: питательный агар (готовая питательная среда производства ООО «Биокомпас-С», ТУ 10-02-02-789-176-94). Оптимальная температура для роста 32°С. Культивирование в течение 48 часов.
Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.
Бактерии представляют собой мелкие прямые палочки длиной 1,5-2 мкм, образуют споры. На питательном агаре образуют кожистые колонии кремового цвета пастообразной консистенции с неровными изрезанными ризоидными краями и плоским профилем; матовая поверхность в центре переходит в блестящую к краю колонии. Диаметр колоний 10-15 мм. Оптимальная температура роста 32°С; при температуре более 45°С и менее 15°С рост замедленный. Оптимальное значение рН среды 7,1; рост происходит также при рН от 4,5 до 8,0.
В качестве единственного источника углерода штамм использует декстрин, мальтозу, целлобиозу, сахарозу, туранозу, стахиозу, раффинозу, глюкозу, маннозу, фруктозу, галактозу, манитол, глицерол, пектин. Использует минеральные формы азота: соли аммония и нитраты. Каталазо- и оксидазо-положительный желатин не гидролизует. Утилизирует аминокислоты: L-аланин, L-аргинин, L-аспартам, L-глутамин, L-серин; органические кислоты: лимонную, яблочную, γ-аминомасляную, α-кетомасляную, ацетоуксусную, уксусную. Проявляет сахаролитическую, амилолитическую, липолитическую активность. Обладает способностью к денитрификации и азотфиксации. Растет при 10% NaCl.
Экспериментально установлено, что штамм Bacillus megaterium V3 обладает фитостимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйственным культурам, в частности, к овсу, кресс-салату, редису, томатам, винограду, а также древесным культурам, в частности к ели и сосне.
Так, в лабораторном опыте определяли ростостимулирующую активность штаммов Bacillus megaterium V3 и Bacillus megaterium 501 GR на растениях кресс-салата сорта «Данский». Для этого были приготовлены 0,1%, 1% и 10% растворы бактериальных суспензий исследуемых штаммов с изначальным титром бацилл (1,2-1,3)10 9 КОЕ/мл. Семена кресс-салата помещали в стерильные пробирки, заливали приготовленными растворами исследуемых штаммов и замачивали на 30 мин. В контроле семена замачивали в стерильной водопроводной воде. Подготавливали «влажные камеры»: в стерильные чашки Петри раскладывали фильтровальную бумагу и увлажняли стерильной водопроводной водой объемом 6 мл на камеру. Семена кресс-салата стерильным пинцетом помещали на поверхность влажных камер по 20 шт. на чашку. На каждый вариант делалось минимум 3 повторности. Влажные камеры помещали в фитотрон и инкубировали 5 суток при температуре 28°C. После инкубации измеряли длину побега и корня проростков. Полученные данные обрабатывали с помощью программы Excel. Результаты опыта представлены в Таблице 1.
Были проведены микровегетационные опыты, в которых определяли влияние бактерий Bacillus megaterium на развитие корневой системы и на развитие зеленой массы растений овса сорта «Боррус» (Avena sativa L.).
Микровегетационный опыт по влиянию бактерий Bacillus subtilis Ч-13 и Bacillus megaterium V3 на развитие зеленой массы растений овса сорта «Боррус» также проводили в вегетационном боксе с 16 часовым световым днем, температурой 22°C и интенсивностью света 5000-6000 люкс. Пластиковые стаканчики, объемом 0,5 л, набивали стерильным кварцевым песком по 470 г и проливали 72 мл раствора PNS. На сосуд высаживали по 9 семян овса, предварительно замоченных в суспензии изучаемых штаммов (10 7 КОЕ/мл) в течение 30 минут, без проращивания. Растения выращивали в течение 28 дней, после чего замеряли биометрические параметры. Результаты опыта представлены в Таблице 3.
Нестерильные семена предварительно проращивали при 28°C в течение двух суток до появления корешков 2-5 мм. Инокуляцию проростков проводили ночной (20-ти часовой) культурой изучаемых штаммов, выращенных на жидкой среде LB. Для этого семена помещали в чашку Петри и замачивали на 30 минут в рабочем растворе бактериальной суспензии с титром 10 7 КОЕ/мл, после чего высаживали в почву по 12 штук на сосуд. Титр бактериальных суспензий определяли методом последовательного разведения при высеве на агаризованную среду LB. В качестве аналога для оценки эффективности использовали штамм Bacillus subtilis Ч-13. Растения выращивали в течение 98 дней, после чего производили съем и оценку биометрических показателей и урожайности растений. Результаты опытов представлены в Таблице 4.
Были проведены опыты по определению влияния штамма Bacillus megaterium и Bacillus subtilis Ч-13 на биометрические показатели ели и сосны
Высокая ростостимулирующая активность заявляемого штамма эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3 вызвана способностью создавать с растением растительно-микробную систему путем колонизации эндофитными бактериями корневой системы и внутренних тканей (эндосферы) растения, что было подтверждено опытным путем.
Для исследований в качестве растительного материала использовали редис сорта «Ранний красный» (агрофирма «Поиск») и томаты сорта «Carmello» (Голландия). Для опыта из лаборатории были отобраны по две грам-положительных бактерии Bacillus megaterium V3 и Bacillus subtilis Ч-13. Колонизацию корней растений бактериями изучали в гнотобиотических системах, содержащих стерильный кварцевый песок с добавлением 15% питательного раствора (PNS).
Для инокуляции использовали ночную, 20 часовую, культуру микроорганизмов, выращенных на среде LB на качалке при 28°C. После этого клетки бактерий отделяли от ростовой среды центрифугированием и отмывали 0,85% раствором хлористого натрия (NaCl).
Стерильные проростки растений инокулировали, замачивая в течение 30 минут в суспензии бактериальных клеток с концентрацией 10 5 КОЕ/мл.
Для определения численности интродуцируемых бактерий в ризосфере и на поверхности корней, гнотобиотические системы разбирали, ризосферный слой песка с корней смывали водой и помещали на качалку на 1 час (5 мл воды на 1 корень растения).
Отмытый с корней песок использовали в качестве образцов ризосферы. Делали ряд последовательных разведений и учитывали численность интродуцированных бактерий в ризосфере высевом на среду LC. Ризосферный песок, отмытый с корней, высушивали при t=105°C для учета количества бактерий в массе ризосферы растений.
Для определения количества интродуцированных бактерий на поверхности корней (ризоплана), корни растений, отмытые от ризосферного песка, дополнительно промывали 0,85% раствором NaCl, растирали в ступке с 2 мл физ. раствора и делали ряд последовательных разведений. Численность бактерий учитывали на среде LC через 2 суток роста бактерий в термостате при t=28°C. Результаты опытов представлены в Таблицах 6 и 7.
При использовании заявляемого штамма бактерии Bacillus megaterium V3 в составе различных микробных препаратов важным является то, что бактерии образуют споры, что позволяет сохранять эти препараты без потери жизнеспособности бактерий в течение длительного срока, не менее 12 месяцев после их получения.
Ниже приведен пример получения жидкой формы микробного препарата на основе заявляемого штамма эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3.
Жидкая форма биопрепарата на основе штамма Bacillus megaterium V3
Полученный концентрат бактериальной суспензии на основе штамма Bacillus megaterium V3 разводили стерильной водой в соотношении 1:10 или 1:20. Полученную жидкую форму выдерживали в течение 3-5 дней при температуре 20-25°C до получения титра бактерий не менее 1⋅10 8 КОЕ в 1 мл препарата, после чего препарат готов к применению для обработки сельскохозяйственных культур. Жидкий препарат стерильно разливали в полиэтиленовые бутылки или канистры емкостью 0,25; 0,5; 1,0 и 10,0 литров, которые предварительно ополаскивали спиртом.
Благодаря относительно высокой биологической активности используемого штамма и высокой скорости его роста, жидкий препарат в готовом виде, а также в производстве практически не заражается посторонней микрофлорой. Тем не менее необходим постоянный контроль всех этапов получения микробного препарата на основе штамма Bacillus megaterium V3.
Эффективность микробного препарата, полученного на основе штамма бактерий Bacillus megaterium V3 указанным выше способом, была проверена в полевых опытах на южном берегу Крыма, в ГП «Ливадия» г. Ялта в отношении продуктивности винограда сорта «Бастардо магарачский».
Учет проводили по методике «Методическое и аналитическое обеспечение организации и проведение исследований по технологии производства винограда», г. Краснодар, 2010 г. Длину побегов и вызревание лозы определяли в период вегетации растений, а учет массы урожая и его кондиций проводили при уборке урожая. Результаты опыта представлены в Таблицах 8 и 9.
Таким образом, опытным путем было установлено, что штамм эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3 пригоден и перспективен для использования в сельском и лесном хозяйстве в качестве средства для ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных и древесных культур, позволяющего расширить арсенал подобных средств.