Арабиноксиланы что это такое
Арабиноксилан минимизирует главный и острый побочный эффект цисплатина – потерю веса
Аннотация
Протокол эксперимента был одобрен Советом по этике исследований над животными в университете МакМастер в Онтарио, Канада. Самки белых мышей (4 недели) были закуплены в компании Charles River Canada. Период акклиматизации составил одну неделю. Мыши были взвешены и разделены на 7 групп по 5 мышей в каждой на основании минимальной разницы в весе в каждой группе. Средний вес всех мышей, над которыми велся эксперимент (17.43 г при стандартном отклонении ±0.51 г) в начале настоящего эксперимента был определен, как 100% от массы тела. Пять мышей были помещены в отдельные клетки, как группа с нормальным обменом веществ, в хорошо проветриваемой удобной комнате. Мышам был обеспечен свободный доступ к корму и питью. Циклы смены дневного света и темноты составили 12 часов.
Цисплатин и диметилсульфоксид (ДМСО) были приобретены у компании Sigma Aldrich (Оаквиль, Онтарио, Канада). Так как цисплатин хуже растворяется в воде или забуференном фосфатом физиологическом растворе (ЗФР), ДМСО использовался в качестве растворителя для цисплатина (0.1% в объемном соотношении).
В данном эксперименте использовались следующие характеристики BioBran. Обезжиренный экстракт рисовых отрубей был модифицирован путем ферментации гликозидазами, такими как амилаз, галактозидаза и глюкуронидаза, полученными из мицелия грибов шиитаке (lentis edodes). Конечный продукт модифицированных рисовых отрубей был хорошо растворим в воде. Конечный продукт состоял из полисахаридов, в основном была представлена гемицеллюлоза арабиноксилана и протеин (13.2%), определяемые методом Фолина-Чикальтеу (1951). Продукт был произведен компанией Daiwa Pharmaceuticals, Токио, Япония и продавался под торговым названием MGN-3 (BioBran) в Северной Америке. Продукт был любезно предоставлен на безвозмездной основе доктором Хироаки Маеда из компании Daiwa Pharmaceuticals (патент США 5560914).
За одну неделю до введения цисплатина, двум группам мышей вводился BioBran ежедневно путем зондового питания в объеме 0.1 мл при концентрации 10 мг\мл BioBran (сухой вес), растворенных в воде или путем внутрибрюшной инъекции в объеме 0.1 мл при той же концентрации BioBran, растворенных в забуференном фосфатом физиологическом растворе. Доза 1 мг BioBran рассчитывалась на основе рекомендуемой для человека дозы (50 мг\кг). Одна инъекция цисплатина вводилась в объеме 0.1 мл при концентрации 15 мг\кг цисплатина в забуференном фосфатом физиологическом растворе, содержащем 0.5% ДМСО интраперитонеально. Две группы мышей получали воду через зонд или внутрибрюшное введение забуференного фосфатом физиологического раствора, а неделю спустя обеим группам мышей вводился цисплатин. Мыши, получавшие питьевую воду перорально и мыши, получавшие забуференный фосфатом физиологический раствор с или без ДМСО в качестве растворителя для цисплатина, рассматривались как три отдельные контрольные группы. Вес тела каждой мыши отслеживался ежедневно. По сравнению со средним весом всех мышей в начале эксперимента при произвольном проценте 100%, был определен вес тела каждой мыши.
На следующий день после инъекций цисплатина была выявлена потеря веса у мышей в обеих группах с и без введения BioBran. На 5-й день лечения цисплатином наблюдалась еще большая потеря веса у мышей в обеих группах с и без введения BioBran перорально и интраперитонеально. Большая потеря веса наблюдалась у мышей, которым вводили цисплатин без дополнительного введения BioBran. Хотя потеря веса была близка к 20% от стандартного веса тела мышей в группе, где лечение проводилось цисплатином, не было отмечено летального исхода ни одной мыши, а также не выявлено таких побочных эффектов цисплатина, как диарея или кровотечение из прямой кишки. Как показано на рисунках 1 и 2, набор веса тела у мышей начался на 14 день после инъекций цисплатина в обеих группах, а темп восстановления веса у группы мышей, которым вводился BioBran и перорально, и интраперитонеально был быстрее, чем у мышей в контрольной группе.
Интенсивность потери веса у мышей от введения цисплатина зависела от дозы (данные не представлены). Было обнаружено, что пероральное и интраперитонеальное введение BioBran ускорило защиту против резкой потери веса у мышей, вызванной введением цисплатина. На Рисунке 1 показана статистически значимая разница между кривой потери веса, вызванной приемом цисплатина в группе мышей, которым перорально вводился BioBran и мышами, которым давалась питьевая вода. Такие данные были получены в результате дисперсионного анализа (Р
Арабиноксилан
Арабиноксилан. Обзор
Арабиноксилан представляет собой соединение, которое выделяется из внешней оболочки зерен хлебных злаков (пшеница и рис). Он является одним из основных компонентов пищевых волокон, найденных в хлебных злаках. Арабиноксилан доступен в диетической форме дополнительного питания, как БАДы и добавки.
Арабиноксилан предлагает различную пользу для здоровья, включая повышение иммунной функции.
Использование Арабиноксилана для здоровья
В альтернативной медицине, арабиноксилан рекламируется, как натуральное средство для следующих проблем здоровья:
Препарат действует как пребиотик, тип вещества, которое способствует росту пробиотиков (полезных бактерий, показанных для улучшения здоровья кишечника и, которые стимулируют иммунную систему).
Польза для здоровья от Арабиноксилана
Хотя всего несколько исследований проверили использование пищевых добавок, содержащих арабиноксилан, есть некоторые доказательства того, что вещество может предложить целый ряд преимуществ для здоровья. Вот посмотрите на несколько выводов по арабиноксилану и его воздействия на здоровье человека:
1) Сахарный диабет
Арабиноксилан может помочь управлять сахарным диабетом, в соответствии с небольшой долей исследований, опубликованных в Европейском журнале клинического питания.
Для исследования взяты 15 больных сахарным диабетом. Их попросили дополнить свой рацион питания обогащенным арабиноксиланом хлебом, булочками и кексами, сделанными только из цельной пшеницы и белой муки. После пяти недель, участники исследования с применением обогащенных продуктов арабиноксиланом показали значительно большее улучшение контроля уровня сахара в крови.
Арабиноксилан может помочь регулировать уровень сахара в крови у людей без диабета, предполагает небольшое исследование, опубликованное в Американском журнале клинического питания. В этом исследовании были найдены доказательства, подтверждающие значительно более низкие концентрации сахара в крови (по сравнению с периодом, когда они потребляли завтрак, не содержащий обогащенный хлеб арабиноксиланом). В исследование были включены 14 здоровых участников.
2) Здоровье желудочно-кишечного тракта
В исследовании, опубликованном в британском журнале питания у указывается на то, что арабиноксилан может помочь улучшить здоровье кишечника. В клиническом исследовании с участием 63 здоровых взрослых людей, авторы исследования наблюдали, что потребление 10 граммов пшеничных отрубей обогащенных арабиноксиланом каждый день в течение трех недель улучшает несколько маркеров желудочно-кишечного здоровья, в том числе снижение частоты возникновения запоров.
3) Ожирение
Предварительные исследования показывают, что арабиноксилан может помочь в борьбе с ожирением. В исследовании, опубликованном в «PLoS One», например, мышей кормили пищей обогащенной арабиноксиланом, после чего произошло снижение жировой ткани и увеличение веса.
Арабиноксилан также проявил себя в умении снижать уровень холестерина, уменьшать воспаление и улучшать чувствительность к инсулину. Тем не менее, в настоящее время точно неизвестно, может ли арабиноксилан помочь бороться с ожирением у людей.
4) Рак
Арабиноксилан помогает в лечении некоторых типов рака. Например, в исследовании, опубликованном в противораковых исследованиях обнаружили, что сочетание арабиноксилана и интервенционной терапии с участием химиотерапии было полезным в лечении гепатоцеллюлярной карциномы. По сравнению с больными, которым проводили только интервенционную терапию, те больные, которым были назначено комбинированное лечение, имели более низкий рецидив заболевания раком, более высокий уровень выживаемости, а также значительное уменьшение объема опухоли. Клиническое исследование длиной в три года включало 68 пациентов.
Очень важно отметить, что необходимы дополнительные исследования, прежде чем арабиноксилан может быть рекомендован для лечения любого типа рака.
Предостережения при употреблении Арабиноксилана
Данные о безопасности длительного и регулярного применения арабиноксилана в настоящее время отсутствуют. Однако, так как арабиноксилан может понизить уровень сахара в крови, есть некоторые опасения, что использование арабиноксилана в сочетании с препаратами от сахарного диабета может оказывать вредное воздействие.
Имейте в виду, что добавки арабиноксилана не были проверены на безопасность, так как биологически активные добавки не регулируются органами здравоохранения. В некоторых случаях продукт может иметь дозы, которые отличаются от указанной на упаковке. В других случаях продукт может быть загрязнен другими веществами, такими, как металлы. Кроме того, безопасность пищевых добавок у беременных женщин, кормящих матерей, детей и лиц с заболеваниями или которые принимают лекарства, не была установлена.
Где найти добавки Арабиноксилана?
Рекомендации для Арабиноксилана
Из-за ограниченного исследования, слишком рано говорить и рекомендовать Арабиноксилан для профилактики или лечения каких-либо сложных заболеваний. Важно отметить, что само-лечение, предотвращение или задержка стандартного лечения может иметь серьезные последствия. Если вы планируете использовать Арабиноксилан для лечения заболеваний, не забудьте проконсультироваться со своим врачом. Наиболее популярными среди биологически активных добавок к пище содержащих Арабиноксилан являются таблетки «Биобран 250» и порошки «Биобран 1000 (30с)«, «Биобран 1000 (105с)«.
Биологически активная добавка к пище Биобран 250 / Биобран 1000 с Арабиноксиланом
Показания к применению:
Биобран с Арабиноксиланом примененяется как натуропатическое лечение больных с метастазирующими опухолями, прошедших медицинское лечение. Учитывая, что при приеме происходит активизация натуральных киллеров, способных уничтожать клетки рака в соотношении 1:1, важно предварительно уменьшить опухолевую нагрузку при помощи хирургии, химиотерапии и/или лучевой терапии.
Биобран с Арабиноксиланом способен существенно снижать побочные эффекты химио- и лучевой терапии при одновременном применении, улучшая качество жизни пациентов. Наиболее эффективен при лечении лейкемии и множественной миеломы, а также лимфомы, рака простаты, молочной железы и яичников. Применяемый в качестве средства для общего поддержания здоровья, помогает укрепить иммунную систему, увеличивая активность лейкоцитов.
Положительное действие Биобрана с Арабиноксиланом наблюдается также при разрушении энзимов печени вследствие гепатита или под действием определенных токсических веществ, при хронической усталости после вирусных заболеваний и при ВИЧ-инфекции.
При рецидивирующих вирусных инфекциях с межклеточной вирусной персистенцией типа Herpes simples, Herpes zoster, EBV можно провести 2-х месячный курс приема Биобрана с Арабиноксиланом, если лечение другими препаратами не дает желаемых результатов.
При аллергических реакциях Биобран с Арабиноксиланом сдерживает дегрануляцию тучных клеток, уменьшая симптомы аллергии.
Биобран с Арабиноксиланом обладает способностью повышать толерантность к глюкозе, благоприятно влияя на течение диабета, хотя и не является заменителем инсулина.
Таблетки, содержащие по 250 мг арабиноксилана, упакованные в блистер, по 50 таблеток в упаковке.
Порошок для приготовления оральной суспензии, упакованный в саше-пакеты, содержащие по 1000 мг арабиноксилана, по 30 /105 саше-пакетов в упаковке.
Арабиноксилан (MGN-3/Биобран) усиливает клеточно-опосредованную активность NK-клеток в борьбе с нейробластомой in vitro и in vivo
аннотация
исходные цели.
Цитотоксическая активность NK-клеток играет главную роль в иммунологической защите от злокачественных новообразований. NK-клетки появляются в организме как средства для иммунотерапии адоптивного рака. Арабиноксилан (MGN-3/Биобран) был описан как модификатор биологической реакции, который может улучшить цитотоксическую активность NK-клеток. На основании данного исследования был оценен эффект действия MGN-3/Биобран на активность NK-клеток, увеличение их количества и усиление цитотоксичности в отношении клеток нейробластомы. Методы. NK-клетки были обогащены магнитными микроносителями и стимулированы с помощью MGN-3/Биобран. Активность NK-клеток оценивалась с помощью анализа фенотипа, а их способность к размножению отслеживалась. Цитотоксическая способность активированных NK-клеток in vitro была протетстирована в отношении клеточных линий K562, Jurkat, A673, NB1691, A-204, RD и RH-30, цитотоксическая способность in vivo была протестирована в отношении клеточной линии NB1691. Результаты. Стимуляция NK-клеток MGN-3/Биобраном повлекла за собой более высокую экспрессию с ассоциацией рецепторов CD25 и CD69, чем в непростимулированных клетках (P Рисунок 1. Уровни цитокинов в супернатантах культуры были определены с использованием технологии капельной проточной цитометрии Cytometric Bead Array Flex Set (BD Biosciences) и проанализированы с помощью жидкостной цитометрии с использованием жидкостного цитометра BD FACSCalibur (BD Biosciences). (A) TNF-a уровни, (B) IL-6 уровни и (C) IL-8 уровни.
Таким образом, поддержание высокой цитотоксической активности NK-клеток должно быть направлено как на раковых пациентов, так и на здоровое население.
MGN-3/Биорбан – это арабиноксилан из рисовых отрубей, которые были модифицированы с помощью карбогидратных гидролизирующих энзимов грибов shiitake. Было отмечено, что данная пищевая добавка повышает цитотоксическую активность NK-клеток в отношении опухолей взрослых пациентов in vitro и in vivo. Более того, имеются описания синергического противоопухолевого эффекта Биобрана в сочетании с традиционным лечением некоторых раковых опухолей, таких как рак молочной железы и гепатоцелюлярный рак. Эти данные открыли возможность использования MGN-3/Биобрана в качестве вспомогательного метода лечения рака у взрослых пациентов. Однако не имелось никаких данных по использованию препарата для лечения опухолей у детей. Наша цель заключалась в том, чтобы исследовать роль MGN-3/Биобрана в качестве стимулятора NK-клеток против опухолей у детей in vitro и in vivo, а также роль MGN-3/Биобрана в увеличении роста NK-клеток с использованием различных комбинаций цитокинов и стимуляторов клеточных линий.
Методы
Подготовка клеток
Комитет по этике нашего института одобрил это исследование. Периферийные мононуклеарные клетки крови (ПМКК) были выделены с помощью центрифугирования в градиенте плотности из образцов крови, полученных от здоровых волонтёров. Кровь была аккуратно нанесена на равнозначный объем среды Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) и центрифугирована при 400g в течение 20 минут при комнатной температуре. ПМКК были собраны с поверхности, дважды промыты с помощью фосфоросодержащего изотонического раствора (ФИР) и центрифугированы при 400g в течение 10 минут. Затем NK-клетки были обогащены набором магнитных микроносителей (с использованием набора для сепарции NK-клеток или микроносителей CD56; Miltenyi Biotec) (смотрите онлайн на дополнительном рисунке 1 для рецензентов). Цельная кровь была помещена на верхнуюю часть подушки фиколла и центрифугирована при1800 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре. Фракция лимфоцитов/моноцитов была изолирована и промыта с помощью ФИР. Затем пробу подвергли лизису красных кровяных телец (раствор аммониум-хлорида; Stem Cell Technologies) в течение 5 минут при комнатной температуре и дополнительно промыли с поморщью ФИР. Моноциты были культивированы в среде RPMI 1640 medium (Gibco-BRL, Life Technologies Ltd), затем к ним была добавлена 10% фетальная бычья сыворотка в увлажненной атмосфере с 5% CO2 при температуре 37oC. Осажденные на субстрате моноциты были культивированы в течение 7-10 дней для дифференциации макрофагов. Макрофаги использовались в качестве биосенсоров при определении максимальной дозировки MGN-3/Биобран для стимуляции NK-клеток без стимулирования макрофагов.
Реагенты
В исследовании использовались следующие анти-человеческие моноклональные антитела (mAbs): CD3PE-Cy7, CD45-FITC, CD69- FITC и CD314 (NKG2D)-APC (все от компании Becton Dickinson); CD56-APC, CD25-PE, CD336
Таблица I. Быстрое стимулирующее действие Биобран и IL-15 на активацию NK-рецепторов.
Представлены данные MFI, SD, и коэффициенты от 3 здоровых волонтеров контрольной группы. Жирный шрифт указывает на статистическую значимость.
(NKp44)-PE и CD335 (NKp46)-PE (все производства компании Beckman Coulter); CD337 (NKp30)-PE (Miltenyi Biotec). Помеченные флюорохромом mAbs против TLR-4 и TLR-9 были получены из Enzo Life Sciences AG.
Интерлейкин (IL)-15 был получен из CellGe- nix. IL-2 (Пролейкин) был получен из Novartis. MGN-3/Биобран был предоставлен компанией Daiwa Pharmaceuticals Ltd. Липосахарид (LPS; Сигма 0127:B8) был использован в качестве лиганда толл-подобного рецептора-4 (TLR-4), а полимиксин B (InvivoGen) был использован в качестве ингибитора LPS-индуцированной активации TLR-4.
Клеточные линии
Клеточные линии K562 эритролейкемии, Jurkat T лимфоидной лейкемии, A673 опухоли Юинга (все от ATCC), клеточная линия нейробластомы NB1691 (любезно предоставленная доктором А. Давыдовым из Детского Исследовательского Госпиталя Святого Иуды), клеточные линии A-204 эмбриональной рабдомиосаркомы, RD эмбриональной рабдомиосаркомы и RH-30 альвеоларной рабдомиосаркомы (все от DSZM) были использованы в качестве мишеней для испытаний естественной цитотоксичности NK-клеток in vitro. Клеточная линия трансдуцированной люциферазой нейробластомы (NB1691luc) была любезно предоставлена доктором А. Давыдовым и использована in vitro, а также для количественного анализа на мышиной модели in vivo. Облученные линии K562 и K562 с экспрессией мембраносвязанных клеток IL-15 и 4-1BBL (K562-mb15- 41BBL, любезно предоставленная доктором Д. Кампана, Национальный Университет Сингапура) были использованы в качестве питающих клеток для активации и роста NK-клеток.
Фенотипический анализ
Поверхностные фенотипы NK-клеток, стимулированных MGN-3/Биобран (100 Мг/мл), NK-клетки, стимулированных IL-15 (10 нг/мл), нестимулированные NK-клетки и увеличенные в объеме NK-клетки от 3 здоровых взрослых волонтеров были определны с использованием 6-цветной иммуно-флюоресцентной окраски. Мы окрашивали 5 x 105 свежих NK-клеток из различных условий с помощью подходящих мышиных анти-человеческих моноклональных антител в течение 30 минут в темноте при температуре 4oC. Клетки были дважды промыты холодным ФИР, ресуспенсезированы в 0.5 мл ФИР и исследованы с использованием проточного цитометра FACSCanto II (Бектон Дикинсон). Процент позитивных клеток и коэффициенты средней интенсивности флуоресенции (СИФ) были определены для каждого антигена клеточной поверхности. Контроль проводился с использованием подходящих антител для контрольнго изотипа.
Исследования цитотоксичности и стимуляция NK-клеток
(спонтанная секреция – фон) /
(максимальная секреция –фон) x100
NK-клетки от здоровых волонтеров стимулировались с помощью 100 Мг/мл MGN-3/Биобран, 10 нг/мл IL-15, 40 IU/Мл или 1000 IU/мл IL-2 или с помощью комбинации MGN-3/Биобран и 40 IU/мл IL-2. Культуры обрабатывались в питательной среде (RPMI 1640 в совокупности с 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой, 100 IU/мл пеницилином,
100 нг/мл стрептомицином, и 2 ммоль/Л глутамином) в увалжненной атмосфере из 5% CO2 и 95% воздуха. Ц итотоксическая активность оценивалась как описано ранее.
Мышиная модель
Клекти нейробластомы NB-1691luc 2 x 105 были инъекцированы внутривенно NOD-scid IL-2Rgnull мышам в возрасте 12 недель. Для изоляции NK-клеток, мы использовали PBMC от здоровых волонтеров. Затем NK-клетки были обогащены набором магнитных частиц (набор для сепарации NK-клеток, Miltenyi Biotech). Полученные NK-клетки были >90% CD3-CD56. Использовались свежие NK-клетки или NK-клетки, активируемые с помощью 100 Мг/мл MGN-3/Биобран. Внутривенная NK-клеточная терапия началась через 7 дней после инъекции опухолевых клеток и осуществлялась дважды в неделю в течение 4 недель. В двух независимых экспериментах (4 мыши на группу), мы сравнили нелеченный контингент (контрольную группу) с контингентом, получающим 1 x 106 нестимулированные NK-клетки (NK группа) и контингентом, получающим 1 x 106 NK-клетки, стимулированные 100 Мг/мл MGN-3/Биорбан (группа NK-Биобран). Биолюминесцентная интраскопия проводилась после начала терапии NK-клетками на 7-ой, 14-ый, 28-ой и 42-ой дни на фоне интраперитонеальной инъекции 100 мл люциферина, растворенного в ФИР с концентрацией 15 мг/мл.
Через пять минут после введения субстрата, животные были подвержены анестезии с использованием изофлюорана (введение в наркоз на 3%, а затем поддержка на 1,5%), а также Xenogen IVIS Lumina II (количественной флюоресцентной и биолюминесцентной интраскопии, корпорация Xenogen). Снимки были сделаны с различных позиций, а анализ был осуществлен с использованием программного обеспечения для изображения прямой передачи Xenogen (версия 3.2). Для диаграмм биолюминесцентной интраскопии для каждой мыши была определена прямоугольная область исследования, охватывающая весь грудной отдел и живот, суммарный поток (протоны/с), подсчитавался в вентральной позиции и положении лежа при экспозиции 180 секунд. Данное значение было представлено в перерасчете до сопоставимого исходного значения (от люциферин-инъекцированной контрольной мыши-неносителя раковой опухоли). Все эксперименты были проведены согласно нормативам ведомственных комитетов по уходу и использованию животных в соответсвии с критериями, подчеркнутыми в указателях по здоровью национальных институтов по уходу и использованию лабораторных животных.
Активация и увеличение объема NK-клеток
Увеличение объема было достигнуто с помощью 14-дневного изолированного культивирования и культивирования с MGN-3/Биобран 100 мг/мл и цитокинами (100 IU/мл IL-2 или 100 IU/мл IL-2 плюс 10 нг/мл IL-15) или дополнительного со-культивирования с использованием облученных питающих клеток, и клеточных линий, состоящих из клеток K562 или K562-mb15-41BBL. PBMC были получены от 5 здоровых взрослых волонтёров посредством центрифугирования в градиенте плотности (Фиколл). PBMC были выведены в 6-тигранной плоскодонной тарелке с MGN-3/Биобран и цитокинами человека (IL-2, IL-2 ю IL-15) или изолировано, или со-культивированы в пропорции 1:1.5 с помощью сублетальных облученных K562 или K562-mb15-41BBL питающих клеток. В качестве питательной среды использовалась RPMI 1640, в которую была добавлена 10% AB свежезамороженная человеческая плазма, L-глутамин и пенициллин-стрептомицин (Биохром). Свежая среда добавлялась каждые 2 дня. Через 14 дней, клетки были собраны и проанализированы для определения фенотипа и цитотоксичности NK-клеток in vitro NK.
Цитометрический гранулярный слой и исследование проточного цитометра для определения содержания TLR агониста в MGN-3/Биобран
Статистический анализ
Резульаты показаны в форме значений ± SD. Непараметрические тесты Вилконсона были выбраны для сравнения эффекта MGN-3/Биобран на фенотип NK-клеток, цитотоксичность и коэффициент увеличения. В мышиной модели выживание было оценено с помощью одномерного метода Каплана-Мейера и сравнено с использованием логрангового критерия. Статистическое значение было определено как P Рисунок 2. (A) Средняя интенсивность флуоресценции при активации рецепторов NK-клеток: в состоянии покоя (черный цвет), MGN-3/Биобран (красный цвет) и IL-15 стимулированный (зеленый цвет) у трех здоровых подконтрольных. (B) Проценты экспрессии активационных маркеров в состоянии покоя, MGN-3/Биобран- и IL-15-стимулированные NK-клетки.
Исследования цитотоксичности In vitro
Рисунок 3. (A) Цитотоксическая активность MGN-3-стимулированных NK-клеток в отношении клеточных линий K562, NB1691, Jurkat и A673 (эффектор/мишень 8:1), A-204, RD и RH-30 (эффектор/цель 10:1). (B) IL-15 и цитотоксическая активность MGN-3-стимулированных NK-клеток в отношении клеточных линий K562, NB1691, Jurkat и A673 (эффектор/мишень 8:1). (C) IL-2- и цитотоксическая активность MGN-3-стимулированных NK-клеток против A-204, RD и RH-30 (эффектор/мишень 10:1). Данные включают результаты от 3-х здоровых волонтеров в 3 независимых экспериментах.
Стимуляция с помощью MGN-3/Биобран повлекла за собой значительное увеличение цитотоксичности NK-клеток по сравнению со всеми протестированными клеточными линиями при коэффициенте E/T 8:1 (K562, NB1691, Jurkat, A673) или 10:1 (A-204, RD, RH-30) в сравнении с нестимулированными NK-клетками в покое (Рис. 3A, K562 80% против 69%, P ј 0.03, NB1691 41% против 23%, P ј 0.03, Jurkat 40% против 19%, P ј 0.03, A673 34% против 13%, P ј 0.02, A204 34% vs. 18%, P ј 0.03, RD 45% против 22%, P ј 0.002, RH-30 34% против 18%, P ј 0.02). Стимуляция с помощью IL-15 привела к даже более высоким процентам лизиса клеточных линий K562 (100%), NB1691 (61%), Jurkat (60%) и A673 (58%) (Рис. 3B). Чтобы протестировать синергический эффект IL-2 и MGN-3/Биобран, мы сравнили стимуляцию с помощью высокой дозировки IL-2 (1000 IU/мл) с помощью низкой дозировки IL-2 (40 IU/мл) и низкой дозировки IL-2 ю MGN-3/Биобран.
Добавление MGN-3/Биобран к низкой дозировке IL-2 увеличило стимулирующий эффект 40 IU/мл IL-2 и повлекло за собой цитотоксичность, сравнимую с той, что была получена с помощью 1000 IU/мл IL-2 (Рис. 3C). Чтобы протестировать профиль безопасности MGN-3/Биобран-стимулированных NK-клеток, мы провели исследования цитотоксичности по негативным контролям (автологичные негативные клетки CD56), которые показали отсутствие цитотоксичности (дополнительный Рис. 2 и дополнительная Таблица I для обозревателей)
Модель in vivo
Чтобы исследовать, имеет ли стимулирующее влияние MGN-3/Биобрана на NK-клетки in vitro клиническое значение, мы расширили наше исследование до ксенографической модели люциферазы-трансфектированной нейробластомы in vivo. Рис. 4A показывает вентральные и задние био-снимки 3 представителей мышей, получающих PBS (контроль), нестимулированные NK-клетки (1 x 106 )и MGN-3/Биобран-стимулированные NK-клетки (1 x 106 ). Наблюдалась резкая прогрессия опухолей NB1691 в контрольной группе и группе, получающей нестимулированные NK-клетки, в то время как подавление значительного роста нейробластомы наблюдалась в группе, которая получала MGN-3/Биобран-стимулированные NK-клетки(1 x 106 ) (Рис. 4B и дополнительная Таблица II для обозревателей). Мы также обнаружили, что MGN-3Биобран-стимулированные NK-клетки значительно повышали выживаемость в модели NOD/scid/IL- 2Rgnull-hu (P Рисунок 5. (A) Кинетика общих клеток, NK-клеток, T-клеток, NKT-клеток и B-клеток через 14 дней расширенного культивирования от 5 здоровых доноров с MGN-3/Биобрана и цитокинов (IL-2 или IL-2 ю IL-15) и без него (wo) или со-культивирования с помощью облученных питающих клеток, состоящих из клеточных линий K562 или K562-mb15-41BBL. *Статистически значимая. (B) Цитотоксическая активность расширенных NK-клеток с добавлением MGN-3/Биобран в питательную среду.
После 2 недель культивирования NK-клетки увеличились значительнее при добавлении MGN-3/Биобран добавлен в питательную среду (дополнительная Таблица III). В то же время при добавлении MGN-3/Биобран был добавлен в питательную среду увеличение T-клеток было снижено. Добавление MGN-3/Биобран к IL-2 и IL-2 к IL-15 культур не произвело статистически значительного различия в NKT-клетках и B-клетках. Цитотоксическая активность увеличенных NK-клеток значительно не изменилась, когда MGN-3/Биобран был добавлен в питательную среду (Рис. 5B). Для сравнения, добавление IL-15 привело к увеличеннию цитотоксичности в сравнении только с IL-2, даже при использовании трансфектированной клеточной линии K562.
Механизмы MGN-3/Биобран стимуляции на NK-клетки
В связи с тем, что NK-клетки человека могут быть стимулированы с помощью TLR, мы протестировали TLR-антигенную стимуляцию MGN-3/Биобраном с использованием человеческих макрофагов в качестве биосенсоров для определения оптимальной дозы MGN-3/Биобран для стимуляции NK-клеток без стимуляции макрофагов. Только высокий уровень MGN-3/Биобран (10 мг/мл) повлек за собой производство IL-8, IL-6 и TNF-a (4776, 164 и 132 и пг/мл, соответственно), смотрите Рис. 1. Данные измерения были значительно ниже тех, которые наблюдались с помощью LPS (10 нг/мл) стимулирования (7487, 362 и 208 пг/мл, соответственно).
Рисунок 6. (A) LPS-стимулированные NK-клетки повышают цитотоксичность NK-клеток в состоянии покоя в отношении NB1691, а добавление полимиксина B, отменяет LPS стимуляцию в состоянии покоя. (B) MGN-3/Биобран стимулирует NK-клетки в отношении NB1691, с которыми не вступает в противодействие полимиксин B.
Мы наблюдали следы (Eu/мл ј 1.68) содеражния LPS в MGN-3 Биобран в исследовании лизата амёбоцитов мечехвоста (ЛАМ). Чтобы исследовать роль содержания LPS MGN-3/Биобрана в качетсве механизма стимулирования, мы in vitro провели анализ цитотоксичности в отношении NB1691. Эти исследования показали повышенную цитотоксическую активность LPS-стимулированных NK-клеток в сравнении с NK-клетками в состоянии покоя, в то время как полимиксин B снизил влияние LPS стимулирования (Рис. 6A). Для сравнения, стимулирующий эффект MGN-3/Биобран на NK-активность в отношении NB1691 не мог быть антагонизирован с полимиксином B (Рис. 6B). Механизм NK-стимулирования не опосредуется LPS-содержанием в MGN-3/Биобран.
Дискуссия
Опубликованные исследования показали, что использование MGN- 3/Биобран в терапии рака может улучшить результаты у некоторых онкологических пациентов. Клиническое исследование взрослых пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой показало, что дабвление MGN-3/Биобран в интервенциональные терапии, включая трансартериальную хемоэмболизацию, чрескожную инъекцию этанола, радиочастотную абляцию и криоабляцию улучшило общую выживаемость. Также было замечено повышение MGN-3 стимулированного внутреннего иммунитета у пациентов с меиломной болезнью за счет увеличения цитотоксической активности NK-клеток, уровней миелоидных DC и концентраций клеток T-помощников типа l-связанных цитокинов. Нет отчетных данных касательно использования MGN-3/Биобран с детскими опухолями.
Наше исследование показывает, что стимулирование NK-клеток с помощью MGN-3/Биобран воысило цитотоксическую активность как in vitro, так и in vivo против различных опухолевых клеточных линий детских опухолей. Мы продемонстрировали повышенный клеточный цитолиз NK-клеток клеточных линий острого лейкоза, нейробластомы, саркомы Юинга, эмбрионической рабдомиосаркомы и альвеолярной рабдомиосаркомы in vitro после стимулирования с помощью MGN-3/Биобран. Мы также наблюдали значительное подавление роста нейробластомы и значительное увеличение выживаемости у животных с моделью нейробластомы NOD/scid/IL-2Rgnull при использовании MGN-3/Биобран-стимулированных NK-клеток. Эти данные согласуются с предыдущими данными, опубликованными по злокачественных образованиям у взрослых. Механизмы и доза, с помощью которых MGN-3/Биобран повышает активность NK-клеток, остаются неизвестными. Мы полагаем, что различные иммунные механизмы могут быть вовлечены в благотворное влияние, наблюдаемое на фоне лечения NK-клетками, стимулированными MGN-3/Биобраном. В связи с тем, что большие дозировки MGN-3/Биобрана повлекли за собой модификацию макрофагов от M0 до M1, производящего IL-6, IL-8 и TNF-a, мы посчитали, что низкие дозы MGN-3/Биобран убирают активацию NK-клеток, вызванную воспалительным фоном. В связи с тем, что антогонисты TLR могут стимулировать NK-клетки, мы выдвинули гипотезу о том, что содержание LPS в MGN-3/Биобран могло увеличить цитотоксичность NK-клеток по TLR-4-сигналу. В нашем исследовании наблюдалось небольшое количество содержания LPS. Однако вследствие того, что нейтрализация LPS с помощью полимиксина B не отменила стимулирующий эффект MGN-3/Биобран на активность NK-клеток, мы полагаем, что содержание LPS не является механизмом, посредством которого MGN-3/Биобран стимулирует NK-клетки. Согласно нашим данным, MGN-3/Биобран активирует NK-клетки в состоянии покоя, однако, он не в состоянии далее активировать клетки, обработанные IL-15, несмотря на увеличение их экспансии на протяжении этого периода.
Дополнительно, использование MGN-3/Биобран в комбинации с низкодозированным IL-2 повысило цитотоксическую активность NK-клеток до того же уровня, что и высокая дозировка IL-2. Эти данные нахоядтся в соответствии с более ранними исследованиями. Таким образом, MGN-3/Биобран и низкая дозировка IL-2 действуют синергически, и это может способствовать избежать токсического действия при лечении большими дозировками IL-2 in vivo.
Данные исследований здоровых пациентов предложили, что использование MGN-3/Биобран в качестве альтернативыного или адъювантного лечения с различным иммунотерапевтическим подоходом может оказать пользу при терапии злокачественных новообразований. Наши результаты распространяются на педиатрических пациентов вследствие отмеченного увеличения цитотоксической активности NK-клеток с добавлением MGN-3/Biobran в отношении множества педатрических опухолей in vitro и нейробластомы in vivo. Мы также наблюдали, что добавление MGN-3/Биобран повышало экспансию/активацию NK-клеток и в комбинации с низкой дозировкой IL-2, имело благоприятный эффект на активацию NK-клеток с целью иммунотерапии нейробластомы. Оправданы дальнейшие исследования в условиях клинической педиатрии для изучения роли MGN-3/Биобран в комбинации с химио-имунными протоколами.
Данный результат позволяет предположить механизм частичного перекрытия действия с IL-15. Другая теория заключается в апоптотическом эффекте, опосредованном активацией NK-клеток, вырабатывающими TNF-a и IFN-g. Данная теория поддерживается недавно приведенными данными о том, что добавление MGN-3/Биобран в курс химиотерапии имело синергетический эффект. Это показано улучшенным апоптозом и подавлением пролиферации опухолевых клеток у пациентов с раком молочной железы. Иным возможным механизмом могло бы быть увеличение активирующих рецепторов NK-клеток, стимулированных с помощью MGN-3/Биобрана. Мы наблюдали ассоциированное с активацией увеличение рецепторов CD69 и CD25 на MGN-3/Биобран-стимулированных NK-клетках здоровых доноров. Высокий уровень CD69 на NK-клетках корреллирует с увеличением цитотоксичности NK-клеток. Кроме того, пролиферативный потенциал усиливается при усилении экспрессии CD25 на NK-клетки. Наконец, о взаимодействие MGN-3/Биобрана с иными иммунными клетками также сообщалось.
Адоптивный трансфер in vitro активированных NK-клеток на данный момент используется для терапии рака. Недавние исследования продемонстрировали, что NK-клетки можно расширить до большого количества ex vivo, используя различные методы, включая применение K562-mb15-41BBL в качестве питающих клеток. Это увеличивает активность NK-клеток in vitro на множество клеточных линий и злокачественных новообразований, включая и детские раковые опухоли. Когда мы добавили MGN-3/Биобран в различные протоколы экспансии, мы наблюдали увеличение экспансии NK-клеток, задержку цитотоксической активности и сокращение количества T-клеток. Эти данные могут быть важными для масштабного расширения высоко цитотоксического лечебного класса NK-клеток, особенно в аллогенной форме, когда T клетки должны быть удалены, чтобы избежать реакции ТПХ «трансплантат против хозяина».